Пригодилось? Поделись!

Адсорбционная хроматография

АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Разделœение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделœению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделœение зон компонентов зависит от взаимодействия как с растворителœем, так и с адсорбентом.

В основе сорбции на поверхности адсорбента͵ имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (или способным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие между постоянными или индуцированными диполями, образование водородной связи вплоть до образования π-комплексов или комплексов с переносом заряда. Возможным и достаточно частым в практической работе является проявление хемосорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появлению продуктов разложения или необратимой сорбции вещества.

Изотермы адсорбции веществ имеют линœейную, выпуклую или вогнутую форму. При линœейной изотерме адсорбции пик вещества симметричен и время удерживания не зависит от размера пробы. Чаще всœего изотермы адсорбции веществ нелинœейны и имеют выпуклую форму, что приводит к некоторой асимметрии пика с образованием хвоста.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом пор, поверхностью, диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и крайне редко — другие адсорбенты, широко применяющиеся в классической колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого — недостаточная механическая прочность большинства прочих адсорбентов, не позволяющая упаковывать их и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ.

Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и находящиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свойствам близки. По этой причине обычно порядок элюирования смесей веществ и элюотропный ряд растворителœей для них одинаковы. При этом различие химического строения силикагеля и оксида алюминия иногда приводит к появлению различий в селœективности — тогда предпочтение отдают тому или другому адсорбенту, более подходящему для данной конкретной задачи. К примеру, оксид алюминия обеспечивает большую избирательность при разделœении некоторых многоядерных ароматических углеводородов.

Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором силикагелœей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

Адсорбционная хроматография на силикагелœе

Адсорбционную хроматографию с использованием в качестве наполнителя колонок силикагеля очень широко применяют в классическом варианте жидкостной хроматографии. При однократном разделœении силикагель оказывается достаточно удобным, эффективным и недорогим сорбентом. Очень интенсивно используют силикагель в качестве адсорбента для ТСХ (также однократно). Адсорбционная активность силикагеля достаточно легко воспроизводится путем определœенных операций гидроксилирования, сушки, активации. Большой опыт применения силикагеля в ТСХ и колоночной хроматографии, естественно, стимулировал широкое его использование на ранних стадиях развития ВЭЖХ.

Обнаружилось, что при многократном использовании достаточно трудно поддерживать колонку с силикагелœем в условиях работы, при которых времена удерживания и получаемое разделœение оставались бы стабильными (в отличие от ТСХ и классической колоночной ЖХ). Это связано с тем, что алканы, используемые в качестве базовых растворителœей (н - гексан, н - гептан, изооктан), содержат очень небольшое количество воды (десятки ппм) в состоянии насыщения или меньше, если их осушали тем или иным способом. Силикагель в колонке, не имеющий на поверхности адсорбированной воды, является эффективным осушителœем и отнимает воду от растворителя, меняя при этом свою активность как адсорбент. Хроматографические характеристики его при этом, естественно, также изменяются.

Это продолжается до тех пор, пока не установится равновесие между количеством воды, поглощаемой и отдаваемой силикагелœем. В случае если при смене растворителя новая партия будет иметь другую степень насыщенности водой, чем старый растворитель, опять начнется процесс установления нового динамического равновесия, и хроматографические характеристики снова изменятся.

Аналогичный процесс может идти и в обратном направлении, когда растворитель хорошо высушен, а силикагель содержит много адсорбированной воды.

Основная проблема здесь состоит в том, чтобы иметь растворитель, к примеру гексан, с постоянной влажностью, к примеру, составляющей 50% от максимальной. Обычно этого добиваются, смешивая непосредственно перед использованием равные объемы гексана, находящегося в равновесии с водой, и абсолютно безводного.

В случае если увлажнение и осушку проводят идентично и воспроизводимо, то и влажность получается одна и та же, силикагель работает в состоянии динамического равновесия» и Хроматографические характеристики колонки сохраняются. Правда, установление равновесия занимает много времени, так как для установления первоначального равновесия требуется пропустить через колонку более 200 объемов колонки растворителя.

Существуют еще методы, которые позволяют получить воспроизводимые хроматографические характеристики колонки с силикагелœем. Один из них заключается в использовании безводного гексана, модифицированного для получения нужной селœективности метиленхлоридом или ацетонитрилом.

Так как их содержание в генсане существенно выше, чем воды (при равной элюирующей силе), равновесие устанавливается существенно быстрее, и его легче поддерживать. При этом задача получения безводного гексана остается.

В другом методе с использованием гексана при его модификации водой применяют так называемую систему контролируемой влажности (СКВ). Метод основан на создании замкнутого цикла растворителя, который после детектора возвращается в систему через большую колонку с обогреваемой термостатом рубашкой.

Большая колонка содержит силикагель или оксид алюминия (увлажненные) и служит для удерживания компонентов проб и поддержания требуемой влажности гексана.

величивая или понижая температуру в рубашке, можно изменять количество воды в циркулирующем гексане и, следовательно, менять параметры удерживания аналитической колонии. Подробно устройство и работа системы СКВ описаны в литературе [6].

При анализе веществ, достаточно сильно взаимодействующих с силикагелœем, к примеру фенолов, спиртов, часто алифатические углеводороды модифицируют спиртами, к примеру изопропанолом.

На рис. 1 представлена хроматограмма, демонстрирующая высокую селœективность в разделœении сложной смеси метилфенолов и фенола: разделœены изомеры, очень сложно разделяемые методом газовой хроматографии и обладающие очень близкими свойствами, такие, как м и n-крезолы и 2,4- и 2,5-ксиленолы.

Рис. 1. Хроматограмма смеси аминных стабилизаторов полимеров, полученная на колонке размером 250x4,1 мм с силасорбом-600 (5 мкм), подвижная фаза — гексан — метиленхлорид — изопропанол — диэтил-амин (100:10:1:0,01 по объему), расход 1 мл/мин, детектор — УФ (254 нм), проба 2 мкл: 1 — фенил-β-нафтиламин; 2 — N-фенил-N’-изопропил-n-фенилендиамин; 3 — N-1,3-диметилбутил-N’-фенил-n-фенилендиамин; 4 — N,N'-бис(1,4-диметиламил-n-фенилендиамин)

Наиболее сильное влияние на удерживание фенолов оказывает, как видно из хроматограммы, экранирование гидроксильной группы даже такой малообъемной и слабоэкранирующей группой, как метильная. За счет этого различия происходит четкое разделœение на 3 группы: орто -, орто’ - замещенные; орто - замещенные с неэкрани-рованной гидроксильной группой (не имеющей орто - заместителœей). Пример разделœения аминных стабилизаторов — на рис. 2.2.

В общем виде можно сформулировать следующее положение: удерживание в адсорбционной хроматографии на силикагелœе определяется химической природой функциональных групп или групп, способных к взаимодействию с центрами адсорбции на поверхности силикагеля, а также степенью пространственного затруднения при их сближении до наступления такого взаимодействия. В ряду функциональных групп эмпирический ряд увеличения удерживания выглядит следующим образом: фтор — хлор

— бром — иод — простой эфир — трет-амин — нитрил — нитрогруппа — сложный эфир

— кетон — альдегид — первич-ный амин — амид — спирт — фенолкарбоновая кислота

— сульфо-кислота. транс-Изомеры удерживаются слабее, чем цис-изомеры, изомеры с аксиально расположенными группами — слабее, чем с расположенными экваториально. В случае если групповое разделœение (по типу и количеству функциональных групп) методом адсорбционной хроматографии на силикагелœе провести легко, то разделœение членов гомологического ряда внутри таких групп, как правило, достигается только для первых членов и быстро падает с ростом числа метиленовых групп.

Популярность силикагеля в качестве сорбента для ВЭЖХ начала падать с появлением и ростом применения полярных привитых сорбентов, таких, как амин, нитрил и диол. Последние более удобны в работе и позволяют подбирать селœективность, меняя фазу. Тем не менее есть качества силикагеля, которые обеспечивают ему достаточно надежное будущее в ВЭЖХ. Это прежде всœего относительная дешевизна силикагеля, дающая ему большие преимущества при препаративных разделœениях, особенно в том случае, когда масштаб их приближается к производственному. Это хорошая механическая прочность, возможность регулировать размер и объем пор, иметь такой сорбент, который можно отмыть кислотой от ионов металлов переменной валентности, прокалить при высокой температуре и т.д. По этой причине, хотя следует ожидать дальнейшего уменьшения использования силикагеля в аналитической практике, его производство и потребление будут увеличиваться за счет препаративной хроматографии.

Адсорбционная хроматография на оксиде алюминия

Оксид алюминия, так же как и силикагель, широко используют в колоночной хроматографии низкого давления и в ТСХ. Так как имелся большой опыт разделœений, вначале его достаточно интенсивно применяли для ВЭЖХ. При этом постепенно его применение уменьшалось, и в настоящее время встречаются единичные работы, связанные с применением оксида алюминия в качестве адсорбента. Фирмы или не производят сорбентов такого типа, или же производят ранее разработанные (возможно, даже давно произведенные), не разрабатывая новых вариантов.

С чем это связано? Как правило, разделœения, которые проводят на оксиде алюминия, легко бывают перенесены на силикагель или же на привитофазные полярные сорбенты на его основе. Химическая же однородность поверхности силикагеля выше. Каталитическая активность оксида алюминия значительно выше, он гораздо чаще вызывает разложение компонентов пробы или их необратимую сорбцию. При одинаковой цене за грамм в колонку с оксидом алюминия требуется его в два раза больше по массе, чем силикагеля, что вдвое дороже.

Можно считать, что в настоящее время использование оксида алюминия в качестве адсорбента в какой-то мере стимулируется тем, что многие исследователи его имеют и используют, когда пытаются перейти от ТСХ разделœений на оксиде алюминия к ВЭЖХ варианту. Используют его и в тех случаях, когда воспроизводят опубликованные более ранние работы.

При этом следует признать, что, за исключением некоторых особых случаев применения, когда сорбенты на основе оксида алюминия показали повышенную селœективность по сравнению с силикагелœем (к примеру, в разделœении многоядерных ароматических углеводородов, некоторых аминов), применение силикагеля более целœесообразно.

Недостатки адсорбционной хроматографии, ограничивающие ее использование.

Популярность адсорбционной хроматографии по мере развития метода ВЭЖХ постепенно падала, она всœе больше заменялась и продолжает заменяться на другие варианты, такие, как обращенно-фазная и нормально-фазная ВЭЖХ на сорбентах с привитой фазой. Какие же недостатки адсорбционной хроматографии привели к этому?

Прежде всœего, это большая длительность процессов уравновешивания адсорбентов с растворителями, содержащими воду в микроколичествах, трудность приготовления таких растворителœей с определœенной и воспроизводимой влажностью. Из этого следуют плохая воспроизводимость параметров удерживания, разрешения, селœективности. По этой же причинœе невозможно использовать градиентное элюирование — возврат к исходному состоянию настолько длителœен, что значительно превосходит выигрыш времени за счет использования градиента.

Существенные недостатки адсорбентов, особенно оксида алюминия, связанные с частыми случаями перегруппировок чувствительных к катализу соединœений, их разложения, необратимой сорбции, также общеизвестны и неоднократно отмечались в литературе. Необратимо сорбирующиеся вещества, накапливаясь на начальном участке колонки, меняют природу сорбента͵ могут привести к повышению сопротивления колонки или даже к полной ее забивке. Последний недостаток может быть устранен путем использования предколонки, которая по мере повышения сопротивления и забивки заменяется на новую или перезаполняется новым сорбентом. При этом необратимая сорбция, имеющая место и в этом случае, приводит к получению хроматограммы, на которой полностью или частично отсутствуют чувствительные к сорбции или каталитическому разложению компоненты пробы.

РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Распределительная хроматография — это вариант ВЭЖХ, в котором разделœение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределœения между двумя несмешивающимися фазами: растворителœем (подвижная фаза) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза). Исторически первыми были сорбенты такого типа, которые получали нанесением жидких фаз (оксидипропионитрила, парафинового масла и др.) на пористые носители, аналогично тому, как готовили и готовят сорбенты для газожидкостной хроматографии (ГЖХ). При этом сразу же обнаружились и недостатки таких сорбентов, основным из которых было относительно быстрое смывание фазы с носителя. За счет этого количество фазы в колонке постепенно уменьшалось, времена удерживания также уменьшались, на начальном участке колонки появлялись не покрытые фазой центры адсорбции, вызывавшие образование хвостов пиков. С этим недостатком боролись, насыщая растворитель нанесенной фазой еще до его попадания в колонку. Унос также уменьшался, когда использовали более вязкие и менее растворимые полимерные фазы, однако в этом случае из-за затруднения диффузии из толстых полимерных пленок эффективность колонок заметно снижалась.

Логическим оказалось привить химическими связями жидкую фазу к носителю таким образом, чтобы унос ее стал физически невозможен, ᴛ.ᴇ. превратить носитель и фазу в одно целое — в так называемый привито-фазный сорбент.

Первые привито-фазные сорбенты были получены замещением силанольных групп, находящихся на поверхности силикагеля, в результате их реакции со спиртами или аминами. При этом отщеплялась вода, а остатки спиртов или аминов химически прививались к поверхности силикагеля. Эти так называемые «щеточные» сорбенты показали, что с их использованием действительно удается получить высокую эффективность колонок при отсутствии уноса фазы из колонки и стабильности времен удерживания. При этом устойчивость таких сорбентов в условиях применения водных растворителœей и даже слабобазовых или кислых сред была низкой: фаза отщеплялась химически за счет реакции гидролиза.

В дальнейшем усилия исследователœей были направлены на поиск реагентов, прививка которых протекала бы достаточно быстро и полно, а образовавшиеся связи были максимально устойчивыми. Такими реагентами стали алкилхлорсиланы и их производные, позволившие по сходной технологии получать привито-фазные сорбенты разного типа и с разными как полярными, так и неполярными группами на поверхности.

Успешное применение сорбентов последнего типа для ВЭЖХ способствовало росту их производства самыми разными производителями. Каждая фирма производила такие сорбенты, как правило, на основе своего вида силикагеля и по своей технологии, которая обычно составляет «ноу-хау» производства. В результате большое количество сорбентов, называющихся химически совершенно одинаково (к примеру, силикагель с привитым октадецилсиланом), имеют очень сильно различающиеся хроматографические характеристики. Это связано с тем, что силикагель может иметь поры шире или уже, разную поверхность, пористость, его поверхность до прививки может гидроксилироваться или нет, прививаться могут моно-, ди- или трихлорсиланы, условия прививки могут давать мономерный, полимерный или смешанный слой фазы, используются разные методы удаления остатков реагентов, может использоваться или не использоваться дополнительная дезактивация силанольных и других активных групп.

Сложность технологии прививки реагентов и подготовки сырья и материалов, ее многостадийность приводят к тому, что даже полученные по одной технологии на одной фирме-производителœе партии сорбентов могут иметь несколько разные хроматографические характеристики. Особенно это касается тех случаев, когда такие сорбенты используют для анализа многокомпонентных смесей, содержащих вещества, заметно различающиеся по количеству и положению функциональных групп, по роду функциональности [9, 10].

Учитывая вышеуказанное, всœегда следует стремиться к тому, чтобы при использовании описанной в литературе методики анализа применять именно тот самый сорбент и те же условия работы. В этом случае вероятность того, что работу не удастся воспроизвести, является минимальной. В случае если же такой возможности нет, а берется сорбент другой фирмы с аналогичной привитой фазой, нужно быть готовым к тому, что потребуется длительная работа по переделке методики. При этом существует вероятность (и ее следует учитывать), что на этом сорбенте даже и после длительной разработки можно не добиться требуемого разделœения. Наличие в литературе многих описанных методик разделœения на давно производимых старых сорбентах стимулирует их дальнейшее производство и применение по этой причинœе. При этом в тех случаях, когда приходится переходить к разработке оригинальных методик, особенно применительно к веществам, склонным к разложению, хемосорбции, перегруппировкам, целœесообразно начинать работу на сорбентах, разработанных в последнее время и выпускаемых по новым, улучшенным вариантам технологии. Новые сорбенты имеют более однородный фракционный состав, более однородное и полное покрытие поверхности привитой фазой, более совершенные окончательные стадии обработки сорбентов.

Перейдем теперь к рассмотрению групп привито-фазных сорбентов, являющихся в настоящее время основными в ВЭЖХ, а также сорбентов с нанесенными фазами для распределительной хроматографии.

Нормально-фазная распределительная хроматография с привитыми фазами.

Недостатки, присущие адсорбционной хроматографии и подробно рассмотренные в разделœе 2.1.3, а также стремление исследователœей преодолеть недостатки, характерные для распределительной хроматографии с нанесенными полярными фазами, способствовали разработке сорбентов с привитыми полярными фазами. Такие сорбенты, по крайней мере базовых типов, нашедших наиболее широкое применение, в настоящее время выпускаются большинством производителœей.

Основными привитыми фазами для нормально-фазной распределительной хроматографии в настоящее время являются нитрильная и аминная. Каждая из них прививается с использованием соответствующего силана (диметиламинопропилхлор или диметилцианпропилхлорсилана). Нитрильная и аминная привитые фазы бывают в связи с этим использованы в двух вариантах: для нормально-фазной (с неполярными элюентами) и обращенно-фазной (с полярными элюентами) распределительной ВЭЖХ. В качестве нормально-фазных сорбентов они работают, подобно силикагелю или оксиду алюминия, с теми же элюотропными рядами

Рис. 2. Хроматограмма витаминов в пищевых продуктах, полученная на колонке размером 250x4 мм с нуклеосилом NH2 (10 мкм), подвижная фаза — гептан — хлороформ (80:20 по объему), расход 3,5 мл/мин, детектор—УФ (254 нм), проба 5 мкл: 1 — уксусный эфир витамина А; 2 — витамин Е; 3 — витамин Д3

растворителœей и близкими (но не идентичными) порядками элюирования соединœений разных классов. За счет разной химической природы силанольных, амино- и нитрильных групп нередко возникает различие в селœективности разделœения, позволяющее отдать предпочтение тому или иному сорбенту.

Основными преимуществами сорбентов с привитыми нитрильными или аминогруппами по сравнению с адсорбентами являются следующие: 1) вследствие отсутствия силанольных групп вероятность необратимой адсорбции веществ заметно уменьшается; 2) заметно уменьшается влияние воды на хроматографическое разделœение, отпадает крайне важность строго контролировать содержание воды в растворителях; 3) быстро достигается равновесие с новым составом растворителя, что позволяет быстро переходить от методики к методике или успешно использовать градиентное элюирование; 4) возможно использование растворителœей в широком диапазоне полярностей, колонки легко бывают регенерированы; 5) сорбенты с привитыми аминогруппами проявляют свойства слабых анионообменников.

Следует принимать во внимание и некоторые особенности применения сорбентов с аминофазами. Не рекомендуется использовать в качестве растворителœей и компонентов проб вещества с альдегидными или кетонными группами, так как в этом случае возможно разрушение структуры привитой фазы с образованием оснований Шиффа или исчезновение некоторых компонентов проб. Аминофаза может быть легко окислена, в связи с этим следует исключить действие на сорбент сильных окислителœей. Аналогично, при использовании нитрильной привитой фазы следует поинтересоваться, не реагируют ли с нитрилами выбранный растворитель или компоненты, входящие в состав пробы.

Нитрил и аминофазы применяют в биологии, медицинœе, биохимии, фармакологии и др. (рис. 2). Эти фазы нашли наиболее широкое признание и выпускаются почти всœеми производителями сорбентов Некоторые фирмы выпускают варианты аминофаз, содержащие, к примеру, диэтиламиноэтильные или диметиламино-пропильные группы.

Достаточно широко применяют также еще одну привитую полярную фазу — так называемую «диольную», или просто «диол», которая содержит в составе привитой группы две гидроксильные группы. Ее селœективность также будет несколько отличной из-за другой химической природы полярных групп. Сорбенты с такими привитыми фазами выпускают значительно меньшее число производителœей.

Сорбенты с другими привитыми полярными группами (за исключением ионообменников) выпускаются еще меньшим числом фирм или же всœего одной-двумя, а их применение также достаточно редко. Это связано с тем, что какая-то особая селœективность, оправдывающая их применение (рис. 2.6), отмечается довольно редко. С чем же связано то, что многие привитые полярные фазы разных типов, которые были разработаны и даже производились, не приобрели заметной популярности? Ведь в ГЖХ данный путь является основным, позволяющим добиться разделœения на колонке — новая фаза с особыми свойствами, дающая высокую селœективность.

Рис. 3. Хроматограмма моносахаридов, полученная на колонке размером 250x4,6 мм с полигосилом 60 NH2 (5 мкм), подвижная фаза —ацетонитрил — вода (75:25 по объему), расход 2 мл/мин, детектор — УФ (190 нм): 1 — рамноза; 2 — ксилоза; 3 — арабиноза; 4 — фруктоза; 5 — манноза; 6 — глюкоза; 7 — галактоза

Рис. 4. Хроматограмма цитохромов Ц разного происхождения, получен-ная на колонке размером 250х4 мм с нуклеосилом CN (5 мкм), подвижная фаза — 0,05 М раствор сульфата натрия в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 2,0) — ацетонитрил (77,5:22,5 по объему), расход 1 мл/мин, детектор — УФ (400 нм): 1 — лошади; 2 — быка; 3 — собаки; 4 — тунца

Рис. 5. Хроматограмма полициклических углеводородов, полученная на колонке размером 150x4,6 мм с нуклеосилом NO2 (5 мкм), подвижная фаза — изооктан, расход 1,4 мл/мин, детектор УФ (254 нм), проба 20 мкл:

1 — бензол; 2 — нафталин: 3 — фенантрен; 4 — флюорен; 5— пирен; 6 — 1,3,5 -трифенилбензол; 7 — хризен

Главная причина в том, что в ГЖХ молекулы разделяемого вещества вступают во взаимодействие с неподвижной фазой непосредственно, а в ВЭЖХ — только через молекулы сольватированного растворителя, которого тем больше (а влияние привитой группы — слабее), чем больше сольватирующие способности растворителя и сольватируемость полярных групп привитой фазы. Хотя природа привитых полярных групп (нитрил, амин, диол) заметно различается, нивелирующее действие сольвата-ционных оболочек сглаживает эти различия. По этой причине улучшение разрешения заменой сольватирующей полярную группу молекулы или группы молекул на новую путем модификации состава растворителя, введения новых компонентов растворителя или добавок к нему (при сохранении той же привитой полярной группы) часто не только проще для хроматографиста͵ но и дает существенно более значимый результат.

Обращенно-фазная распределительная хроматография с привитыми фазами

Вариант распределительной хроматографии, в котором используют сорбент с привитыми неполярными (как правило, длинными алкильными или алкилсилильными) группами и полярный растворитель, к примеру водный метанол, получил название обращенно-фазной ВЭЖХ. Этот не совсœем удачный термин, указывающий на перемену полярности неподвижной и подвижной фаз на противоположные в данном варианте ВЭЖХ прижился и стал общепринятым, означающим: подвижная фаза полярна, неподвижная — неполярна. В отличие от недостаточно удачного названия сам метод оказался настолько удачным, что в настоящее время является основным в ВЭЖХ. По общим оценкам, каждые два разделœения из трех, появляющихся в литературе и используемых в практической работе, относятся к обращенно-фазной ВЭЖХ в ее разных вариантах, ᴛ.ᴇ. 60—70% работы в данное время проводят этим методом. В чем же причина такой популярности обращенно-фазной хроматографии, что на всœе остальные варианты ВЭЖХ (адсорбционную, распределительную нормально-фазную, ионообменную, эксклюзионную и другие) приходится менее одной трети применений?

Причин таких несколько, и каждая сыграла роль в широком использовании метода обращенно-фазной ВЭЖХ. Были разработаны и быстро внедрены в производство сорбенты для этого метода, имеющие привитые алкилсилильные группы разной длины (от С2 до Саг с прямой алкильной цепью, фенильной и ди-фенильной группами). Растворители, используемые для этого метода (ацетонитрил, метанол, вода, в меньшей мере — тетра-гидрофуран), позволяют работать в широком УФ-диапазоне, так как они УФ-прозрачны со 190-210 (ТГФ — с 220) нм. Это позволяет применять наиболее популярный детектор — УФ-спектрофотометр как при 190-210 нм, где он детектирует неселœективно, и в связи с этим приближается к универсальному детектору (анализ Сахаров, жиров, сложных эфиров, спиртов, олефинов), так и при любой длинœе волны, обеспечивающей селœективное детектирование (к примеру, витамина А при 325 нм). Растворители, используемые в обращенно-фазных разделœениях, относительно легко растворяют практически всœе важнейшие группы веществ, находящихся в организме человека, биологических объектах, используемых в виде лекарственных препаратов, пестицидов, гербицидов широко используемых в органической химии, нефтехимии, биоорганической химии (рис. 2.7-2.10). Сорбенты в обращенно-фазной ВЭЖХ быстро приходят в равновесие

Рис. 7. Хроматограмма смеси ароматических углеводородов, полученная на колонке размером 250х4,6 мм с зорбаксом ОДС (6 мкм), подвижная фаза — метанол — вода (90:10 по объему), расход 1,5 мл/мин, детектор УФ (254 нм), проба 20 мкл: 1 — толуол; 2 — о-ксилол; 3 — трет-бутилбензол; 4 — n-трет-бутилтолуол; 5 — n-трет-амил-толуол; 6 — n-трет-гексилтолуол; 7 — 3,5-ди-трет -бутилтолуол; 8 — трет-гексил-о-ксилол

Рис. 8. Хроматограмма натурального кофе, полученная на колонке размером 150х4,6 мм с нуклеосилом С8 (5 мкм), подвижная фаза — метанол — 0,01 М фосфатный буферный раствор с рН 7,0 (20:80), расход 1,2 мл/мин, давление 12 МПа, температура 25 °С, детектор Уф (280 нм), проба 20 мкл: 1 — кофеин

с новыми растворителями и при изменении состава растворителя, что позволяет переходить от одной методикики к другой с использованием одной и той же колонки, а

также широко применять градиентное элюирование с быстрым восстановлением равновесия сорбента с исходным растворителœем.

Сорбенты дают возможность использовать растворители в широком диапазоне свойств, а также добавки разных типов (соли, кислоты и основания, ион-парные реагенты, органические модификаторы).

Регенерация растворителœей высокой чистоты может быть осуществлена с использованием четкой ректификации. Загрязненный сорбент в колонке может быть промыт и приведен снова в рабочее состояние при прокачивании через колонку растворителœей, удаляющих загрязнения.

При этом в обращенно-фазной хроматографии существуют и некоторые проблемы, которые нужно принимать во внимание и которые часто затрудняют, особенно для начинающих, использование метода.

Прежде всœего, характеристики удерживания и селœективности для обращенно-фазных сорбентов меняются не только при переходе от сорбента одного производителя к сорбенту другого (к примеру, от сферисорба ОДС к партисилу ОДС), формально определяемых как идентичные (силикагель с привитым октадецилсиланом).

Эти характеристики меняются более или менее значительно даже при переходе от одной партии сорбента к другой партии того же производителя.

Проблема эта была отмечена еще в самом начале производства и применения обращенно-фазных сорбентов, однако она не решена и до настоящего времени в полном объеме.

Для прививки фаз, которые далее называют одинаково, применяют разные агенты, при этом их чистота (технических сортов, используемых для производства) также различна.

Напри мер, для получения привитой фазы ОДС (октадецилсилан) используют

Рис. 9. Хроматограмма смеси полибромсодержащих антипиренов, полученная на колонке размером 250х4,6 мм с зорбаксом ОДС, подвижная фаза — метанол, расход 1 мл/мин, детектор—УФ (254 нм), проба 10 мкл: 1 — гексабромбутен-2; 2 — гексабромбензол; 3,4 — примеси; 5 — декабромдифенилоксид

октадецилтрихлорсилан, метилоктадецилдахлорсилан и диметил-октадецилхлорсилан. В случае если используют ди- или три-функциональные силаны, то в зависимости от степени безводности растворителœей и силикагеля, на поверхности может получиться мономерная пленка фазы (монослой) или же полимерная (чем больше воды, тем выше степень полимеризации). Свойства мономерной и полимерных пленок с разной степенью полиме-

ризации заметно различаются. Наконец, силанольные группы, находящиеся на поверхности исходного силикагеля, к которым прививается фаза, не могут из-за пространственных затруднений быть полностью замещены, к примеру, диметилоктадецилсилильными группами: в самых жестких условиях прививки удается заместить примерно половину силанольных групп. Остающиеся силанольные группы не удается полностью устранить даже в процессе так называемого окончательного покрытия поверхности силикагеля («энд кэппинга»), когда используют молекулы более активного низкомолекулярного силана (обычно триметилхлорсилана). Силанольные группы на поверхности такого привитого сорбента могут взаимодействовать с некоторыми компонентами пробы и в некоторых случаях быть основным фактором, отвечающим за удерживание. Нередко они действуют не непосредственно, а через посредство малых поляризуемых молекул растворителя (метанола, воды), сольватированных силаноль-ными группами. В некоторых случаях, когда в удерживании вещества участвуют как привитые, так и силанольные группы, это приводит к образованию хвостов пиков.

Интересно проследить, как производители сорбентов меняли свои программы по мере развития представления о химии поверхности привитых сорбентов и о роли силанольных остаточных групп. К примеру, фирма «Ватман» первоначально выпускала только один сорбент вида ОДС — партисил ОДС, который был одним из первых появившихся в продаже обращенно-фазных сорбентов и широко применялся. При этом содержание углерода в нем составляло только 5%, и степень покрытия поверхности составляла 50% от возможной. Далее был выпущен партисил ОДС-2, который содержал уже 15% С, но степень покрытия поверхности увеличилась только до 75%, ᴛ.ᴇ. покрытие стали получать более плотное, и пленка стала полимерной. Последним появился партисил ОДС-3, содержащий 10% углерода, однако со степенью покрытия 95%. Это достигнуто за счет того, что привитая фаза стала мономерной и окончательное покрытие проводилось дополнительно. Аналогично партисилам ОДС выпущены сферисорбы ОДС и ОДС-2, Р-силы С18 двух типов («высокой прививки» и «низкой прививки»). Те же производители сорбентов, которые появились на рынке позже и использовали технологию, учитывающую недостатки старых сорбентов и технологий их получения, как правило, сразу выпускали сорбент с максимальным покрытием поверхности мономерным слоем фазы, а для устранения остаточных силанольных групп пользовались окончательным покрытием.

У начинающего хроматографиста сразу возникает вопрос: почему производители не заменяют старый сорбент, который вроде бы хуже, на новый, а выпускают новый дополнительно? Второй вопрос, так же естественно возникающий: если есть новые, более совершенные сорбенты с улучшенной химией поверхности, то почему продолжают производить и покупать старые сорбенты, к примеру лихросорб РП-18, при этом часто по ценам, даже более высоким? Конечно, причина не в том, что старые сорбенты хорошо и умело рекламируются: та же фирма «Ватман» рекомендует теперь партисил ОДС как «уникальный сорбент, работающий и по механизму обращенно-фазной, и по механизму aдcоpбциoннoй хроматографии», партисил ОДС-2 — как «рабочую лошадку исследовательской лаборатории, стабильно и длительно работоспособную», а партисил ОДС-3, естественно, как «наиболее инœертную обращенную фазу с оптимальным покрытием и наименьшим влиянием остаточных силанольных групп».

Причина в том, что не только производители, но и хроматографисты заинтересованы в выпуске старых сорбентов наряду с новыми, более совершенными. Приобретая старый сорбент, хроматографист приобретает и возможность использовать всœе имеющиеся в литературе разработки, выполненные на этом сорбенте. Переход на другой сорбент, как правило, сопряжен с большими затратами труда и времени на переработку и доводку методики — нередки случаи, когда после длительной работы исследователь убеждается в том, что на новый сорбент перенести методику не удается. Каждый сорбент в чем-то уникален по свойствам, и полное совпадение их у двух сорбентов хотя в принципе и возможно, однако маловероятно. По этой причине чем больше выбор сорбентов и заполненных ими колонок у исследователя, тем легче ему работать, тем легче использовать накоп-

ленный опыт, тем меньше времени он тратит на переделки методик. Это не значит, конечно, что, воспроизведя методику, исследователь не может попытаться использовать более новый и эффективный сорбент, другой растворитель и т.п. — он всœе это может спокойно попробовать, зная, что в случае неудачи вернется к воспроизведенной методике с использованием сорбента ранее упомянутого в литературе.

Из этого обсуждения следует еще один важный вывод: ни один сорбент, как бы хорош он ни был по химии поверхности, технологии получения, не может быть использован для воспроизведения или решения любых методик или задач. Исследователь всœегда должен располагать возможностью использовать ряд сорбентов для решения возникающих аналитических задач.

По этой причине на третий вопрос, который обычно задают начинающие хроматографисты, — какой обращенно-фазный сорбент является наилучшим, — ответить однозначно не удается ни одному исследователю с большим опытом работы. Обычно он честно и коротко говорит: «Я не знаю». Он может сказать, какой сорбент или сорбенты наиболее подходят для его работы, которые в связи с этим наилучшие для него. Он может поделиться опытом работы с этими сорбентами, знает, как их упаковывать, с какими растворителями работать, как регенерировать. При этом дать совет, какой сорбент является наилучшим вообще, очевидно, не может никто, независимо от предшествующего большого опыта.

Одна из причин, способствовавших быстрому росту применения обращенно-фазных сорбентов в ВЭЖХ, — это их способность четко разделять серии гомологов в порядке возрастания их молекулярной массы, делающая их в этом чем-то сходными с популярными в ГЖХ полиметилсилоксановыми фазами. При этом гомологи могут, в отличие от разделяемых методами адсорбционной или нормально-фазной хроматографии, не иметь функциональных групп — обращенно-фазный сорбент может так же четко разделить гексан и гептан, бензол и толуол, фенол и n-крезол, mреm-бутилтолуол и трет-амилтолуол. Это вовлекает в область анализа методом ВЭЖХ такие важные объекты, как углеводороды нефти, продукты нефтепереработки (бензины, керосины, газойли, смазочные масла, ароматические углеводороды), сланце- и углепереработки — очень важные многотоннажные продукты. В случае если нужно разделить вещества неполярные или малополярные, практически любой обращенно-фазный сорбент может при относительно простом подборе растворителя обеспечить почти идентичное разделœение.

Сегодня фирмы-производители выпускают разные обращенно-фазные сорбенты. Как видно из этого перечня, практически всœе производители выпускают привитые фазы С3 и C18 (последние нередко в нескольких вариантах), многие — C1-С3 (что нередко обозначает одно и то же — прививку триметилхлорсилана, иногда диметилдихлорсилана), некоторые — фенил, С4 или С6. В случае если плотность прививки фазы одинакова, то сорбент будет содержать для С4 - фазы в 2 раза меньше, а для C18 - фазы более чем в 2 раза больше привитого углерода, чем фаза С3. На практике эта плотность несколько падает в ряду С4—С8—C18, в связи с этим содержание углерода для С4 несколько больше, а для C18 — меньше, чем можно было ожидать. Так как удерживание соединœений в обращенно-фазной хроматографии пропорционально содержанию привитого углерода (точнее, той части привитого углерода, которая доступна для взаимодействия с молекулами разделяемых веществ), то для сорбентов, одной торговой марки удерживание увеличивается в ряду С2—С4—C8—C18. При этом если взять сорбенты разных производителœей, то заранее ничего сказать нельзя: нередко в таком случае сорбент с С8-фазой удерживает не слабее, а сильнее, чем с фазой C18, выпускаемой другой фирмой.

Наряду с неполярными привитыми фазами, выпускаемыми специально для обращенно-фазной хроматографии, в обращенно-фазном варианте часто используют нитрильную и аминную привитые фазы, а иногда и диольную. В этом случае они работают и разделяют вещества в основном по обращенно-фазному механизму, как имеющие короткий (Сз) привитой алкилсилан, а полярные группы или не участвуют в разделœении, или играют второстепенную роль, несколько меняя селœективность для ряда веществ определœенной химической структуры.

В качестве растворителœей для обращенно-фазной ВЭЖХ используют преимущественно метанол и ацетонитрил. Другие спирты, кроме метанола, используют редко, так как их вязкость значительно выше и при работе возникает слишком большое давление, а эффективность падает вследствие затрудненной диффузии в подвижной фазе. Тетрагидрофуран также используют значительно реже, во-первых, из-за нестабильности при хранении (он быстро окисляется, накапливая гидропероксиды, которые уменьшают диапазон УФ-пропускания, способны окислять привитую фазу и взрывоопасны), во-вторых, из-за трудности очистки перегонкой (крайне важно разрушать пероксиды до перегонки во избежание взрыва).

Ацетонитрил имеет ряд преимуществ перед метанолом. При хорошей очистке он лучше пропускает в ближнем ультрафиолетовом диапазоне (ниже 210 нм) и позволяет работать в смеси вода — ацетонитрил при 200 и даже 190 нм. Он обычно обладает лучшими растворяющими свойствами для проб, чем метанол. При использовании смесей метанол — вода вязкость такой смеси не является аддитивной величиной (так же как и для смесей ацетонитрил — вода) и при 25 °С меняется от 0,89 и 0,57 МПа⋅с (для чистых воды и метанола соответственно) до 1,4 (цифры для смеси ацетонитрил — вода соответственно 0,89, 0,43 и 0,98). Большая вязкость смесей метанол — вода по сравнению со смесями ацетонитрил — вода (почти в 1,5 раза) затрудняет использование колонок, заполненных частицами сорбента размером 3 и 5 мкм, при использовании водно-метанольных смесей. Точно так же при градиентном элюировании колонки, работающие с системой метанол — вода, подвергаются при равном расходе действию больших давлений и быстрее выходят из строя. Наконец, не малую роль играет и то обстоятельство, что метанол относится к группе особо опасных ядов, находящихся на строгом контроле и учете, тогда как ацетонитрил к этой группе не относится.

К недостаткам ацетонитрила, несколько ограничивающим его использование, относятся его довольно высокая стоимость (особенно высокочистых сортов, предназначенных для ВЭЖХ и УФ-спектроскопии), некоторая токсичность, требующая предосторожностей при работе, а также то, что его труднее, чем метанол, освобождать от воды, так как он образует азеотропную смесь с водой. Это затрудняет его регенерацию из отработанного растворителя, что особенно важно при большом масштабе работы, к примеру, при препаративной работе.

Особо следует сказать о качестве воды и о требованиях к ней. Вода, являющаяся в настоящее время одним из важнейших растворителœей для ВЭЖХ, является как самым доступным, так и очень трудным для тщательной очистки растворителœем. В случае если для изократических разделœений, особенно при использовании не очень чувствительных шкал и работе не в ближнем УФ-диапазоне удается обойтись бидистиллятом (не деионизи-рованной водой!), то для градиентной работы и работы с высокочувствительными детекторами такого качества воды уже недостаточно. Деионизированная вода, как правило, не подходит для использования в ВЭЖХ: органические иониты, используемые для извлечения из нее неорганических ионов, дают воду с очень низкой проводимостью, однако очень заметно обогащенную органическими загрязнениями по сравнению с водой до деионизации. Удалить всœе органические соединœения из воды очень трудно, особенно микроколичества — никакая перегонка или ректификация не помогают, так как вследствие образования азеотропных смесей отделить примеси органических соединœений не удается.

Существуют системы высокой очистки воды, осуществляющие деионизацию с последующим извлечением органических соединœений адсорбентами, однако они достаточно дороги. Разработаны системы, позволяющие резко уменьшить содержание органических соединœений в воде путем обработки ее мощным УФ-облучением, иногда с последующей обработкой адсорбентами. Эти системы дешевле, но не так универсальны. Наконец, существуют патроны, заполненные адсорбентом, рассчитанным на извлечение органических соединœений из определœенного объема воды (обычно из 15 л) — они достаточно недороги и удобны, позволяют получить ровно столько очищенной воды, сколько нужно для ближайшей работы. Высокочистая вода нестабильна при хранении, в связи с этим лучше ее использовать достаточно быстро и свежеприготовленную.

Как же поступить в том случае, если таких систем или патронов в распоряжении исследователя нет? Тогда следует взять наиболее чистую воду, имеющуюся в лаборатории, и пропустить ее через колонку, заполненную чистым обращеннофазным сорбентом с привитой фазой C18. Все органические примеси из воды будут сорбироваться в начале колонки, а чистая вода без примесей — накапливаться в сосуде. После пропускания определœенного объема воды, зависящего от количества органических загрязнений в ней, колонку промывают чистым метанолом или ацетонитрилом, смывая загрязнения, после чего она снова готова к работе.

Возможны разные варианты такой очистки. Можно просто при использовании градиента высокого давления установить колонку с привито-фазным сорбентом C18, желательно не обладающую большим гидравлическим сопротивлением (с зернением 20 или 15 мкм), после насоса, подающего чистую воду, до смесителя. В этом случае колонка будет очищать ровно столько воды, сколько нужно для работы, и вода будет самая свежеочищенная. Можно использовать стеклянную колонку, заполнив ее более крупным препаративным сорбентом (к примеру, 40 — 63 мкм), и подавать воду под гидростатическим давлением, получая столько воды, сколько нужно на день работы. Можно, наконец, использовать полупрепаративную или препаративную колонку для ВЭЖХ и качать воду насосом хроматографа, используя для очистки воды ночное время, когда аналитическая работа не нужна. Какой вариант удобнее, решает сам исследователь. Работая в градиентном режиме с водно-метанольными и водно-ацетонитрильными растворами, всœегда следует ежедневно дегазировать растворители наилучшим из возможных способов, особенно если используют градиент на стороне низкого давления. Никогда не будет лишним иметь на выходе из детектора клапан или гидравлическое сопротивление, поддерживающее в кювете детектора избыточное давление около 0,05 — 0,3 МПа. .Это простое приспособление позволяет добиться того, что пузырьки воздуха, если они и образуются, образуются уже после такого клапана, за кюветой детектора, и не мешают работе.

Распределительная хроматография с нанесенными фазами

Этот вариант распределительной жидкостно-жидкостной хроматографии был одним из первых, примененных для ВЭЖХ. При этом в отличие от ГЖХ, где нанесение на носитель жидкой неподвижной фазы является наиболее популярным методом работы, обеспечивающим большую часть аналитических разделœений, он не нашел в ВЭЖХ широкого применения и был вытеснен привито-фазными сорбентами. Тем не менее, работы с его использованием проводят, и в некоторых случаях применение распределительной хроматографии с нанесенными фазами вполне оправдано.

Неподвижную фазу и растворитель обычно подбирают таким образом, чтобы они были практически взаимно нерастворимы. Это понятно, так как в противном случае нанесенная фаза будет быстро вымываться из колонки растворителœем. Такими комбинациями фазы и растворителя являются, к примеру, трис (цианэтокси) пропан и гексан, парафиновое масло и вода. При этом при работе с такими системами компоненты образца, как правило, обладают коэффициентами распределœения близкими или к нулю, или к бесконечности, ᴛ.ᴇ. или элюируются с фронтом растворителя без разделœения, или задерживаются в колонке бесконечно долго. Методы нанесения неподвижной фазы бывают разными. Фаза может быть растворена в подходящем растворителœе с низкой температурой кипения и нанесена методом испарения, как это делают в ГЖХ. Фаза может быть нанесена непосредственно в виде жидкости или пара. В обоих случаях заполнение колонок представляет трудности, если частицы сорбента меньше 40 мкм и не бывают использованы для заполнения «сухим» способом.

Более популярным является динамический метод нанесения неподвижной фазы. Он заключается в том, что носитель, к примеру силикагель с размером частиц от 5 до 10 мкм, вносят в колонку обычным суспензионным способом. На колонку подают заданный объем раствора неподвижной фазы, потом прокачивают растворитель, насыщенный неподвижной фазой, до установления равновесия. Носитель в колонке равномерно покрывается неподвижной фазой, она находится в равновесии с насыщенным фазой растворителœем. Такая система будет стабильной и не нуждается в восстановлении из-за уноса фазы. Насыщение растворителя фазой может проводиться в предколонке с той же фазой, устанавливаемой после насоса до инжeктоpa и периодически заменяемой. Недостатки распределительной хроматографии с нанесенными фазами следующие. Невозможно использовать градиентную ВЭЖХ из-за уноса фазы. Невозможно работать в препаративном режиме, так как собранные фракции, естественно, будут содержать заметное количество нанесенной фазы, остающейся в образце после упаривания растворителя. Трудно менять состав растворителя, так как при этом колонка длительно приходит в новое равновесное состояние с новым растворителœем. Затруднено использование повышенных температур для анализа, так как растворимость неподвижной фазы при повышении температуры заметно возрастает. Растворитель, в который вводится проба, должен по составу быть максимально близким к подвижной фазе, иначе возможны частичный смыв веподвижной фазы, ложные пики и нарушение процесса хроматографии. Несколько слов о носителœе и его желательных характеристиках для распределительной хроматографии с нанесенными фазами. Он должен иметь достаточно большой объем пор, быть при этом прочным механически (допускать суспензионное заполнение колонки), иметь крупные поры и не очень большую поверхность. Наносимая фаза не должна быть высоковязкой, чтобы не было затрудненного массообмена и снижения эффективности разделœения по этой причинœе.

Литература:

1. Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях: Пер. с англ. М., Мир, 1980. 245 с.

2. Жидкостная колоночная хроматография/Под ред. 3. Дейла, К. Мащека, Я. Янака. Пер. с англ, (в 3-х томах). М., Мир, 1978.

3. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1985. 536 с. 9 Berendsen G. E., DeGalan R./l. Chromatogr., 1980, v. 196, No. 1, p. 21—37.

4. Cooke N. H. C., Olsen /(./J. Chromatogr. Sci., 1980, v. 18, p. 1—12.

5. Scottt C. D., Lee N. E./J. Chromatogr., 1973, v. 83, p. 383—393.

6. Kabra P. M., Marion L. J. Liquid Chromatography in Clinical Analysis. Humana Press, Cliftond, 1981. 466 p.

7. Edelson E. H., e. a./J. Chromatogr., 1979, v. 174, p. 409—419.


Адсорбционная хроматография - 2020 (c).
Яндекс.Метрика