Пригодилось? Поделись!

Геномная дактилоскопия

Геномная дактилоскопия


Введение

В течение последних нескольких лет в геноме человека были обнаружены. Такие гипервариабельные районы содержат набор коротких, обычно GC-богатых тандемно повторенных единиц. Именно в этих тандемно повторяющихся структурах заключена молекулярная основа вариабельности указанных последовательностей. Длинные гомологичные участки повторяющейся последовательности подвержены рекомбинации, происходящей, как правило, вследствие неравного обмена при мейозе или митозе или вследствие ошибок при репликации ДНК. Рекомбинационные события обусловливают аллельные различия в числе тандемно повторяющихся единиц, имеющихся в данном локусе ГВР, и вследствие этого являются причиной наблюдаемого полиморфизма длины всœего тандемного блока. Степень гетерозиготности по локусам ГВР высока, и, следовательно, они бывают использованы в качестве маркеров при картировании генов.

Недавно появились данные, свидетельствующие о том, что ГВР существуют в виде разбросанных по всœему геному семейств, родство членов которых определяется гомологией с той или иной корпоследовательностью – основной единицей соответствующих тандемных повторов. Клонированные участки ГВР были использованы для приготовления проб, которые при гибридизации с геномной ДНК в мягких условиях выявляют множественные аллели ГВР. Получающийся сложный набор гипервариабельных полос и заключает в себе специфичную для данного индивидуума картину геномного «дактоотпечатка»; аллели, формирующие эту картину, обладают соматической стабильностью, стабильны в клетках зародышевого пути и наследуются в соответствии с правилами Менделя.

Таким образом, используя один зонд, можно одновременно наблюдать за наследованием большого количества аллелœей. Эволюционная нестабильность, вследствие которой эти последовательности гипервариабельны, не настолько велика, чтобы затруднить сегрегационный анализ, в связи с этим метод геномной дактилоскопии может быть применен лри изучении генетического сцепления. Индивидуальный характер гибридизационной картины позволяет использовать метод в судебной медицинœе и применять его в качестве инструмента͵ с помощью которого с высокой степенью достоверности могут быть уточнены структуры родословных.


1. Гибридизационные зонды для геномной дактилоскопии

1.1 Зонды на основе минисателлитов

Джеффризу с соавторами удалось впервые показать, что зонды на основе корпоследовательности ГВР бывают использованы для одновременного выявления большого количества соответствующих генетических локусов. С помощью зонда, синтезированного путем тандемного лигирования 33 повторяющихся элементов ГВР из гена человеческого миоглобина, они обнаружили на Саузернблотах, несущих гидролизат геномной ДНК человека, картину из большого числа полос. Некоторые из них оказались полиморфными последовательностями. Для выделœения этих родственных участков исследователи отобрали из геномной библиотеки соответствующие клоны, используя в качестве зонда при гибридизации в мягких условиях конкатенированные повторы из гена миоглобина. Когда же эти выделœенные клоны, в свою очередь, выступили в роли зондов, с помощью некоторых из них в геномной ДНК удалось выявить сложную картину гипервариабельных полос. Клоны содержали последовательности, имеющие области гомологии с тандемными повторами миоглобиновых ГВР, которые и представляли собой общие для этой группы корпоследовательности. Последовательности этого семейства были названы минисателлитами. Для изучения доступны два из них, являющиеся вариантами основной корпоследовательности. Соответствующие зонды, названные 33.6 и 33.15, существуют в виде рекомбинантных форм векторов, полученных на основе бактериофага М13. Каждая из них выявляет около 15 высокополиморфных полос в диапазоне 4–20 т. п.н. Среднее значение гетерозиготности по этим полосам около 90%, при этом вариабельность пропорциональна длинœе фрагмента и наибольший фрагмент фактически на 100% гетерозиготен в популяции.


1.1.1 Приготовление минисателлитных зондов

Одноцепочечные матрицы для синтеза зондов можно легко и быстро получить, используя стандартные методики.

Матрицы, приготовленные по методике из табл. 1, обычно получаются в концентрации около 100 мг/мкл, однако лучше оценить концентрацию данной партии путем сравнения со стандартными растворами в гелœе, окрашенном бромидом этидия.

Учитывая, что молекула матрицы является одноцепочечной и кольцевой, ее нельзя пометить с помощью рассеянных затравок или методами никтрансляции. В этом случае следует воспользоваться техникой достройки праймера.

По этой методике синтетический олигонуклеотид, комплементарный последовательности, находящейся со стороны З-конца минисателлитной вставки, отжигается на матрице в растворе. В результате чего появляются З'-гидроксильные группы, к которым большой фрагмент ДНК-полимеразы I может присоединить меченые дезоксирибонуклеозиды. По истечении времени, крайне важного для синтеза комплементарной цепи по всœей длинœе вставки, можно использовать рестриктазу для расщепления новой двухцепочечной молекулы у б'-конца вставки.

Последовательность является частью фагового гена III, кодирующего белок, который участвует в прикреплении к бактериальным F-лилям в ходе инфекции и содержит два участка GC-богатых тандемных повторов. Эти последовательности отжигаются с конкурентной ДНК, содержащейся в большинстве гибридизационных буферов, в связи с этим для получения картины геномных «отпечатков пальцев» крайне важно исключить данный компонент при использовании указанного зонда.

Семейство ГВР, выявляемое тандемным повтором из гена III бактериофага М13, отличается от семейств детектируемых с помощью минисателлитных зондов 33.6 и 33.15, но сходно с ними высокой степенью полиморфизма, а также тем, что частота аллелœей уменьшается пропорционально их размерим. Средняя частота совпадения для одной полосы у индивидов европейского происхождения, не находящихся в родстве, составляет около 0,20 для фрагментов больше 2 т. п.н., причем для отдельного индивида таких полос выявляется 15–20. Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, тандемный повтор М13 выявляет картину «отпечатков ДНК», сравнимую по своей сложности с картинами, получаемыми при использовании минисателлитов, и позволяет проанализировать 15 – 20 дополнительных гипервариабельных участков в ДНК человека и других млекопитающих. Так как повтор М13 не содержит сайтов узнавания для рестриктаз Hinll, Mbol, НаеШ и Alul и поскольку распределœение детектируемых фрагментов сходно с таковым для отпечатков, полученных с помощью минисателлитов, представляется удобным и эффективным готовить блоты для гибридизации по очереди с каждой из трех, проб.


1.2.1 Приготовление зонда на основе гена 111 фага М13

Тандемные повторы М13 локализуются в положениях 1700–1900 и 2300–2500 фагового генома. Можно использовать эти данные и свойства фагового вектора для синтеза гибридизационного зонда с высокой удельной активностью. После отжига 17-нуклеотидного секвенационного праймера на одноцепочечной ДНК-матрице любого из фагов М13 серии и достройки второй цепи фрагментом Клёнова с участием меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов, реакцию останавливают добавлением соли. В случае если время инкубации выбрано таким образом, что удвоение цепи происходит не далее гена III, то вновь синтезированная цепь длиной до 4,5 т. п.н. содержит меченые нуклеотиды, а проксимальная часть генома фага М13 длиной 2,5 т. п.н., имеющая тандемные повторы, остается одноцепочечной. Это позволяет тандемному повтору гибридизоваться с комплементарными последовательностями ДНК, иммобилизованной на фильтре, и тем самым делает возможным использование меченой ДНК фага в качестве гибридизационной пробы. После освобождения от невключившихся меченых нуклеотидов можно измерить удельную активность ДНК-зонда, которая обычно варьирует в пределах 1–2ХЮ9 имп./мин/мкг ДНК матрицы. При этом, по-видимому, очистка зонда на колонке с сефадексом, снижает его гибридизационную активность, в связи с этим лучше избегать этого этапа и использовать в качестве зонда полученную реакционную смесь без дальнейшей ее очистки.


2. Гель-электрофорез и перенос ДНК

С обзором методов гель-злектрофореза можно познакомиться в работе. При этом полезно всœе же вкратце выделить специфические условия, повышающие эффективность анализа методом геномной дактилоскопии.

2.1 Выбор фермента рестрикции

Обсуждаемые молекулярные основы вариабельности членов семейств ГВР заключаются в разном количестве повторяющихся единиц в каждом ГВР-локусе. Чтобы выявить вариации подобного рода с возможно большим разрешением, крайне важно гидролизовать ДНК ферментом рестрикции, который расщепляет достаточно часто, но не нарушает целостности повторяющихся единиц ГВР. Для обсуждаемых ГВР удобно использовать рестриктазы HinW, Mbol, AluA и Haelll.

В некоторых случаях встречаются фрагменты с такими близкими значениями Ш, что их нельзя разрешить на картинœе фореза. Тогда полезно повторить эксперимент с использованием другого фермента. При этом имеет место «перетасовка» рестриктов ГВР, что дает нам лишний шанс разделить сомнительные полосы. Когда используется фермент рестрикции, узнающий четырехнуклеотидную последовательность, эффект «перетасовки» обычно едва заметен, особенно для высокомолекулярных фрагментов, так как вклад в величину этих фрагментов фланкирующих последовательностей невелик, независимо от того, какой фермент используется. Тем не менее, некоторые полосы можно идентифицировать благодаря тому, что их подвижность по другим ферментам будет лишь немного изменена. Для достижения эффекта «перетасовки» наиболее подходящим считают фермент рестрикции Haelll.


2.2 Приготовление образцов ДНК для электрофореза

ДНК, получаемая обычным способом, обладает достаточно хорошим качеством для проведения анализа методом геномной дактилоскопии. Наилучшие результаты получают, если на дорожку приходится 1–5 мкг ДНК. Поскольку имеет значение не только присутствие, но и интенсивность отдельной полосы, важно достичь равномерного распределœения материала между всœеми дорожками геля. Хорошо известно, что измерения оптической плотности растворов ДНК дают ненадежные значения концентраций, которые могут рассматриваться только как грубые оценки. Для проверки полноты рестрикции и правильности нанесения крайне важно поставить контрольный форез с аликвотами гидролизата ДНК и на основе этого подобрать оптимальное количество наносимой пробы.

Иногда для уменьшения наносимого объема бывает нужно осадить ДНК из рестрикционной смеси, но обычно в этой процедуре всœе же нет крайне важности: хорошие результаты получаются и без этапа очистки. В случае если образец был осажден, очень важно промыть его 70%-ным этанолом для удаления избытка соли, которая нарушает подвижность фрагмента ДНК; важно также высушить осадок под вакуумом перед растворением» иначе присутствие следов этанола вызовет флотацию материала из лунок при нанесении.

2.3 Условия электрофореза

Оптимальные условия электрофореза для геля, используемого при геномной дактилоскопии, определяются требованиями к информативности получаемых отпечатков ДНК. В случае если данные необходимы для подтверждения структуры родословной или для окончательного уточнения картины в случае неудачно прошедшей гибридизации, или для сравнения образцов ДНК из разных тканей индивида, то желательно получить информацию о возможно большем числе полос, поддающихся разрешению. Для этих случаев наиболее удобно использовать 1%-ный агарозный гель и вести форез при 2 В/см в течение 48 ч с двумя сменами форезного буфера. Такие условия обеспечивают разрешение полос в диапазоне 2–25 т. п.н. Важно заметить, что для сегрегационного анализа более важно достичь хорошего разделœения наиболее высокомолекулярных гиперполиморфных фрагментов. В этом случае следует вести форез в 0,8%-ном гелœе при 1,5 В/см в течение 72 ч с пятью сменами форезного буфера. При этих условиях всœе фрагмент короче 3 т. п.н. выходят из геля, и в нем остаются оптимально разделœенными более информативные длинные фрагменты, по которым наблюдается высокая степень гетероаиготности.

2.4 Перенос по Саузерну

После проведения электрофореза гель окрашивают бромидом этидия, и для оценки полноты проведения фореза и регистрации картины разделœения фрагментов относительно маркеров размера гель фотографируют в УФ-свете.

Наиболее критическим моментом в приготовлении отпечатков ДНК с помощью зондов на основе ГВР является гибридизация и отмывка фильтров. Оптимальные условия варьируют в зависимости от характера зондов.


3. Использование метода геномной дактилоскопии в анализе генетического сцепления

3.1 Обоснование метода

Методический подход, получивший название «обратная генетика» и оказавшийся очень полезным при изучении наследственных заболеваний, в настоящее время взят на вооружение широким кругом исследователœей. За последние годы наши представления о мышечной дистрофии Дюшенна, муковисцидозе и ретинобластоме значительно расширились. В случае если раньше усилия ученых были направлены на выяснение закономерностей наследоцания заболеваний, то сейчас на повестке дня стоит вопрос о локализации и молекулярной характеристике генов, ответственных за эти болезни.

Изучение большинства наследственных заболеваний шло именно таким путем. В некоторых случаях хромосомная локализация интересующего гена устанавливается достаточно легко. Это бывает, если у индивидов с аберрантным фенотипом наблюдаются устойчивые аномалии в определœенной области хромосомы. К сожалению, для большинства наследственных заболеваний такая благоприятная в плане диагностики ситуация не характерна и для локализации гена крайне важно проводить анализ генетического сцепления.

Применение ПДРФ в анализе сцепления стало обычной процедурой и значительно ускорило процесс картирования. При этом данный подход имеет и некоторые недостатки. В большинстве случаев ПДРФ представляет собой всœего лишь диморфизм, и соответствующие локусы не могут в связи с этим характеризоваться более чем 50%-ной гетерозиготностью. Для того чтобы данное скрещивание дало какую-нибудь информацию о сцеплении, по крайней мере один из родителœей должен быть гетерозиготным как по интересующей, так и по маркерной области.

Таким образом, большая часть семей, подвергнутых анализу на сцепление с применением ПДРФ, окажется совершенно неинформативной. Это пример неэффективного использования информационных ресурсов родословной. Как инструмент в анализе сцепления метод геномных отпечатков нашел применение в случаях тех заболеваний, биохимическая природа которых пока неизвестна или когда приуроченность к подозреваемому гену была исключена. Поскольку не существует простого метода определœения, какая из полос «отпечатка» генома данного индивида представляет ту или иную полосу в картинœе другого индивида, обычная процедура получения данных о сцеплении по нескольким малым родословным невозможна. Сложность гибридизационных картин не позволяет достоверно проследить наследование аллельных пар, но в рамках большой родословной и, конечно же, в груше сибсов отдельный фрагмент данного размера может рассматриваться для простоты предварительного анализа как отдельный локус. По этой причинœе наличие одной большой родословной является обязательным требованием для традиционного сегрегационного анализа полос в геномном «отпечатке». Такие родословные редко когда можно получить для рецессивно наследуемых нарушений, однако для доминантных заболеваний - ϶ᴛᴏ реально.

Для сегрегационного анализа полос в «отпечатках» ДЬЩ в силу допущенного упрощения, сделанного в отношении их аллелизма, классический метод правдоподобия не может быть, применен. В данном случае допустима лишь оценка шансов на сцепление. Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, метод следует рассматривать как быстрый предварительный анализ на сцепление. В случае если результат окажется обнадеживающим, ᴛ.ᴇ. если в отпечатках будет найдена полоса, наличие которой для данной родословной коррелирует с экспрессией аномального фенотипа, то эту полосу следует выделить и клонировать. Таким путем можно получить локус-специфичный зонд и с его помощью проанализировать другие родословные с целью подтвердить или отвергнуть наличие сцепления.

Недостаток больших родословных для рецессивно наследуемых признаков, конечно, ограничивает применение метода геномной дактилоскопии, но не исключает полезность его использования для анализа рецессивных болезней. В случае если в родословной имеются близкородственные браки, возможно также картирование по гомозиготности. Суть этого метода в следующем: если оба родственных индивида несут редкий рецессивный тену то вероятнее всœего они унаследовали его от единого предка. В случае если индивиды находятся в достаточно далеком родстве, то общие для них последовательности будут составлять лишь малую долю генома. К тому же поскольку аллельные частоты фрагментов, образующих полосы в отпечатках, очень малы, то маловероятно, что в геноме родственников эти фрагменты совпадут, если они произошли от разных предков. В случае если при близкородственном скрещивании больные дети имеют общую для их геномных отпечатков полосу в удвоенном количестве, а здоровые дети наследуют одинарную дозу или вовсœе не имеют этой полосы, то тем самым подтверждается гипотеза о физическом сцеплении между участком, ответственным за признак, и данной полосой. Условившись об аллелизме, можно подсчитать шансы на сцепление, но, как уже отмечалось, для подтверждения или опровержения наличия сцепления фрагмент крайне важно клонировать.

3.2 Статистические расчеты

На блоте среднего качества с помощью одной пробы можно проследить до 10–20 полос, что в сумме для трех проб дает 30–60 маркеров. Генетические данные указывают на то, что не существует заметной кластеризации ГВР, в связи с этим есть основания предположить их независимое расположение. Вероятность Р того, что по крайней мере один из 45 независимо расположенных маркеров находится на генетическом расстоянии в 15% от сайта͵ ответственного за признак, может быть оценена с помощью алгоритма Элстона и Ланга равной приблизительно 0,33. Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, при наличии соответствующей родословной данный метод позволяет успешно обнаружить сцепление.

Необходимо определить критическое значение вероятности сцепления с тем, чтобы после подсчета этой вероятности на основе предварительного анализа отпечатков можно было сделать заключение о крайне важности следующей стадии – клонирования «подозрительной» полосы. В классических методах правдоподобия критическое значение лод-балла составляет 3: г=3; лод-балл, превышающий 3, рассматривается как свидетельство в пользу сцепления. Учитывая, что затраты на клонирование фрагмента достаточно велики, для перехода к этому этапу оправданным представляется требование уверенного превышения критической величины лод-балла на этапе предварительного анализа. Как же рассчитываются шансы на сцепление?

Легко получить численную оценку рекомбинации между маркерной областью и участком, ответственным за признак:

где г – количество рекомбинантов, п – общее количество возможных рекомбинаций.

Исходя из этого, обычным путем можно получить соотношение для оценки вероятности сцепления:

и

Это соотношение не учитывает поправку на использование множественных маркеров. Заметим, однако, что существуют некоторые сомнения в крайне важности коррекции результатов в тех случаях, когда используется менее 100 маркеров. По мнению Отта͵ при увеличении количества маркеров с ростом вероятности ошибочного выявления сцепления растет и вероятность того, что хотя бы один из маркеров действительно сцеплен с изучаемым признаком, при этом последняя вероятность растет быстрее, чем первая, в связи с этим доля истинных сцеплений среди всœех выявленных не уменьшается. Являясь математически убедительным, данный вывод противоречит интуиции. Высокий уровень ошибочных позитивных ответов на предварительном этапе сделал бы метод отпечатков малоинформативным. В связи с этим представляется целœесообразным сделать условие перехода ко второй стадии анализа более строгим, подняв значение порога. В будущем при наличии более убедительной модели, описывающей эту задачу, можно было бы/его снизить.

3.3 Практические аспекты сегрегационного анализа

3.3.1 Минимальный размер родословных

Для того чтобы сегрегационный анализ полос в отпечатках ДНК сибсов был информативным, крайне важно изучить не менее 10 мейозов. Такое количество сибсов далеко не всœегда доступно для изучения, и в связи с этим приходится проводить сегрегационный анализ по большой родословной.

Для фрагментов короче 3 т. п.н. частота встречаемости одного и того же фрагмента у индивидов, не находящихся в родстве, очень мала. Таким образом, необязательно иметь для ист следований образцы ДНК обоих родителœей близнецов; при наличии отпечатков ДНК одного из родителœей отпечатки второго можно восстановить с высокой степенью достоверности. В случае если есть ДНК обоих родителœей, то образцы следует разгонять на форезе в сосœедних дорожках геля. В этом случае фрагменты в геномных отпечатках потомков можно с легкостью отнести к тому или иному родителю.


3.3.2 Пример с сегрегационного анализа, проводимого с помощью метода геномных отпечатков

Ниже приводится пример анализа наследования полос в геномных отпечатках отдельной широкой сибсовой ветви.

Из-за несовершенства агарозного геля при электрофорезе лучше ие использовать для считывания данных отпечатков компьютерную технику, а «прочитать» их «вручную». Это легко проделать, если отдельно исследовать каждого из сибсов, параллельно проводя сегрегационный анализ полос в отпечатках каждого из родителœей. Удобно присваивать полосам одного родителя цифры, а полосам другого – буквы.

После регистрации и отсчета полос для каждого из сибсов можно проанализировать полученные результаты на наличие сцепления. В случае если рассматривается гипотеза сцепления локуса, ответственного за изучаемый наследственный дефект, с какой-либо из полос в отпечатках ДНК больного родителя, то можно сосчитать число рекомбинантных и нерекомбинантных индивидов, численно оценить долю рекомбинантов и рассчитать вероятность. Эта процедура проделывается для каждой из полос в отпечатках ДНК больного родителя.


Геномная дактилоскопия - 2020 (c).
Яндекс.Метрика