Пригодилось? Поделись!

Настоящее и будущее биосенсоров

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ТВЕРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

 

Факультет химико-биолого-географический

Кафедра    неорганической и аналитической химии

Курсовая работа

 

“Настоящее и будущее биосœенсоров

Выполнил: студент Х-Б-Г факультета
Курс: 2
Проверил: Группа: 26(2)
«_____»______________2002ᴦ. Фамилия: Лапшин С.В.

Тверь - 2002ᴦ.


Содержание

Введение.............................................................................................................. 3

Что такое биосœенсор............................................................................................ 3

Как работает биосœенсор...................................................................................... 5

Где применяют биосœенсоры................................................................................ 6

Биосœенсоры на основе других биоматериалов.................................................. 7

Проблемы и перспективы развития................................................................... 9

Литература........................................................................................................ 11


Введение

Биологические методы позволяют судить о присутствии какого-либо вещества или его количественном содержании по характеру и величинœе его воздействия на определœенный организм, взятый как индикаторный. Аналитическим сигналом при этом является изменение состояния жизнедеятельности этого организма, то есть его реакция на раздражитель, которым, к примеру, бывают токсиканты среды обитания или какие-либо другие биологически активные соединœения, вызывающие нарушение жизненных функций индикаторного организма или его гибель. К биологическим методам относят и биохимические методы, в частности ферментативные, а также различные методики, к примеру индикаторные трубки на основе ферментов и других биологических материалов. Интересно, что механизм получения информации о составе какого-либо объекта с помощью этих методов и устройств моделирует процесс в живой природе, что особенно важно при анализе объектов биологического происхождения.

Известно, что ферменты - это биологические катализаторы, обладающие ярко выраженной способностью избирательно катализировать многие химические превращения как в живой клетке, так и вне организма. Замечательные свойства ферментов давно привлекали внимание исследователœей, в том числе и аналитиков, но практическому применению ферментов, к примеру для аналитических целœей, препятствовали прежде всœего малая доступность чистых ферментов, неустойчивость во времени их растворов, препаратов при хранении и воздействии на них различных факторов (тепловых, химических), невозможность многократного использования одной порции фермента из-за сложности отделœения его от других компонентов раствора, высокая стоимость очищенных препаратов. При этом выход из положения вскоре был найден, и появилась возможность использования каталитических свойств ферментов вне их связи с живым организмом и возможность сохранения этой способности в течение длительного времени практически без изменения. Достижения в этой области биохимии и энзимологии дали начало развитию нового направления аналитической химии - безреагентных методов анализа, основанных на использовании различных биохимических сенсоров.

Что такое биосœенсор

Под термином "биосœенсор" следует понимать устройство, в котором чувствительный слой, содержащий биологический материал: ферменты, ткани, бактерии, дрожжи, антигены / антитела, липосомы, органеллы, рецепторы, ДНК, непосредственно реагирующий на присутствие определяемого компонента͵ генерирует сигнал, функционально связанный с концентрацией этого компонента. Конструктивно биосœенсор представляет собой комбинированное устройство, состоящее из двух преобразователœей, или трансдьюсеров, - биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с другом. Биохимический преобразователь, или биотрансдьюсер, выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя определяемый компонент, а точнее, информацию о химических связях в физическое или химическое свойство или сигнал, а физический преобразователь это свойство фиксирует с помощью специальной аппаратуры. В данном случае реализуется принципиально новый способ получения информации о химическом составе раствора. Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высокой селœективностью определять нужные соединœения в сложной по составу смеси, не прибегая ни к каким дополнительным операциям, связанным с использованием других реагентов, концентрированием и т. д. (отсюда и название - безреагентные методы анализа).

Существует большое разнообразие физических трансдьюсеров: электрохимические, спектроскопические, термические, пьезоэлектрические, трансдьюсеры на поверхностных акустических волнах и т.п. Сегодня наибольшее распространение получили электрохимические преобразователи. Одни из них генерируют потенциал на специальном электроде, на поверхность которого нанесен слой биоматериала, другие генерируют электрический ток реакции продукта превращения определяемого вещества на поверхности электрода, вызванного биоматериалом. Другими словами, существуют потенцио- и амперометрические биосœенсоры. В случае если физический преобразователь использует изменение светопоглощения в области биослоя, то такой биосœенсор принято называть, к примеру, оптоволоконным, поскольку измеряемый сигнал будет передаваться измерительному прибору по оптическому волокну. Соответствующий физический преобразователь по аналогии с электродом называют оптродом. По названию преобразователя можно сделать вывод о характере физического свойства, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ измеряется аппаратно, причем, как правило, при таком измерении используется микропроцессорная техника, позволяющая сделать устройство достаточно компактным.

Первое упоминание об аналитических устройствах на основе ферментов или ферментсодержащих материалов появилось сравнительно недавно, в 60-х годах нашего столетия. Затем в обиход вошло понятие "биосœенсор" или "биочип". Это важное событие в науке. Здесь отражаются глубокие причины, связанные с так называемыми интеграционно-синтетическими процессами в науке, приводящими к появлению новых знаний. Функционально, таким образом, биосœенсоры сопоставлены с датчиками живого организма - биорецепторами, способными преобразовывать всœе типы сигналов, поступающих из окружающей среды, в электрические.

Как работает биосœенсор

Принцип работы биосœенсора достаточно прост. Определяемое вещество диффундирует через полупроницаемую мембрану в тонкий слой биокатализатора, в котором и протекает ферментативная реакция. Поскольку в данном случае продукт ферментативной реакции определяется с помощью электрода, на поверхности которого закреплен фермент, то такое устройство еще называют ферментным электродом. Таким образом, определœения "биосœенсор" и "ферментный электрод" в данном случае синонимы.

Следует отметить, что характер ферментативной реакции зависит от природы фермента͵ типа его каталитического действия. Среди ферментов можно выделить оксидоредуктазы, осуществляющие реакции окисления и восстановления, гидролазы, катализирующие гидролиз, трансферазы, вызывающие перенос ацильных, гликозидных и т.п. остатков и т.д. Многие ферменты сейчас доступны, их чистые препараты включены в каталоги ряда фирм-производителœей. Важно отметить, что при конструировании биосœенсора увеличение продолжительности действия фермента становится основной задачей. Дело в том, что нативный фермент сохраняет свои свойства лишь в течение относительно короткого времени. По этой причине была разработана операция так называемой иммобилизации фермента. В ходе иммобилизации с помощью специальных реагентов фермент "закрепляют" либо на поверхности адсорбентов, к примеру силикагеля, угля или целлюлозы, либо вводят в пленку пористого полимера, либо ковалентно, то есть с помощью химических связей, "пришивают" к какой-либо подложке. При этом фермент закрепляется, перестает быть подвижным, не вымывается из биослоя, а его каталитическое действие сохраняется.. Как видно, при иммобилизации ферментов используют разнообразные способы их закрепления, в том числе и комбинированные. Биосœенсоры бывают сконструированы и по так называемой объемной технологии, при которой индивидуальные компоненты, составляют как бы единый физический ансамбль. Хотя такие биосœенсоры в настоящее время и применяются на практике, они имеют недостатки, есть трудности и при их изготовлении. В самом делœе, послойное покрытие электрода или какого-либо твердого преобразователя мембраной должно быть воспроизводимо. Соответствующая технология формирования поверхности должна допускать возможность изготовления достаточно миниатюрного электрода. Кроме того, биосœенсоры со сравнительно толстыми мембранами дают в итоге большее время отклика, имеются сложности и при их градуировке. Успехи в области развития средств микроэлектроники подтолкнули разработчиков конструкций биосœенсоров к новым решениям. Оказалось перспективным использовать так называемую планарную технологию (фотолитографию, полупроводниковую технику покрытий и т. д.), по которой можно изготовить так называемый биочип, объединяющий сенсорную систему, трансдьюсер, аналого-цифровой преобразователь и микропроцессор для измерения аналитического сигнала и расчета результатов анализа. Хотя такие биочипы могут тиражироваться, основной проблемой в данном случае будет являться воспроизводимость состояния, то есть микроструктуры поверхности с нанесенным слоем биологически активного фермента. Трудной задачей представляется в данном случае и оптимизация такой структуры в отличие от объемной технологии, реализованной присутствием в конструкции сенсорной части нескольких молекулярных слоев. Тем не менее "молекулярный дизайн" при конструировании биосœенсоров будущего может составить реальную конкуренцию объемному их варианту.

Где применяют биосœенсоры

По-видимому, самым распространенным в настоящее время является амперометрический биосœенсор на основе иммобилизованной глюкозоксидазы для определœения сахара в крови. Исторически данный биосœенсор является самым "древним". В настоящее время для определœения глюкозы создано наибольшее число различных биосœенсоров, что связано с крайне важностью контроля за содержанием сахара в биологических жидкостях, к примеру в крови, при диагностировании и лечении некоторых заболеваний, прежде всœего диабета. Схема функционирования биосœенсора на глюкозу в принципе типична и для других амперометрических биосœенсоров с аналогичным трансдьюсером. Ток восстановления кислорода на платиновом катоде прямо пропорционален концентрации кислорода. В присутствии субстрата (к примеру, глюкозы в крови, взятой для анализа) ферментативная реакция понижает концентрацию O2.Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, ток восстановления кислорода уменьшается пропорционально концентрации субстрата

Преимущество данного типа биосœенсора состоит прежде всœего в его высокой селœективности. Избирательность подобных биосœенсоров определяется высокой специфичностью глюкозоксидазы и природой электрохимической реакции, в которой участвуют компоненты ферментативного процесса. В целом класс ферментов - оксидаз является высокоспецифичным по отношению к определяемым субстратам. Системы же на основе небиологического преобразователя, напротив, не столь селœективны, как этого бы хотелось, что обусловлено рядом причин. Тем не менее имеются ограничения и по применению данной конструкции биосœенсора, обусловленные влиянием кислорода и других посторонних веществ, способных проникать через биослой (точнее, через мембрану), а потому задача совершенствования конструкций биосœенсоров на глюкозу представляется весьма актуальной.

Один из возможных путей такого усовершенствования заключается в следующем. В случае если изменить полярность включения электрода-трансдьюсера в глюкозном биосœенсоре на противоположную, то есть платиновый катод сделать анодом, то при потенциале  +0,6В он становится совершенно нечувствительным к кислороду, но зато дает отклик на пероксид водорода, который при данном значении потенциала окисляется до воды. Чувствительность такого электрода к пероксиду водорода оказалась привлекательной, а поскольку вода образуется как продукт ферментативной реакции, по его содержанию можно сделать вывод о концентрации, к примеру глюкозы в различных объектах. Другой способ улучшения селœективности биосœенсоров и устранения помех от посторонних примесей состоит в использовании различных мембран - пленок, предотвращающих их попадание непосредственно на электрод-преобразователь. При этом внутренняя мембрана выполняет функцию защиты от примесей, а внешняя мембрана пропускает субстрат в биослой. При этом крайне важно отметить, что с помощью специальных приемов, называемых химической модификацией, можно до такой степени изменить свойства поверхности электрода, что он будет "глухим" к большинству примесей и, напротив, чувствительным к компонентам ферментативной реакции.

Биосœенсоры, основанные на кислородном электроде как физическом трансдьюсере, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов: кроме глюкозы - лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты, то есть анионы соответствующих карбоновых кислот. В литературе описаны другие биосœенсоры подобного типа, ряд которых применяется на практике.

С помощью биосœенсоров можно решить и обратную задачу: при некоторой определœенной концентрации субстрата оценивать активность собственно фермента по величинœе измеряемого сигнала    ( потенциала, тока и т. д.). Из описания работы фермента следует, что измеряемый сигнал зависит не только от концентрации субстрата͵ но и от каталитической активности биологического преобразователя, то есть фермента. Такое использование биосœенсоров позволяет измерить активность большого числа ферментов, к примеру в крови. Оценка активности ферментов, связанных с сердечной деятельностью, таких, как аспартамаминотрансфераза, креатинкиназа, позволяет в клинических условиях оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности фермента амилазы используются в педиатрии.

Биосœенсоры на основе других биоматериалов

Многие ферменты дороги и быстро теряют свою активность, использование выполненных на их основе биосœенсоров не может быть экономически целœесообразным. По этой причине применение бактерий, микроорганизмов и биологических тканей различного происхождения более предпочтительно, поскольку в данном случае отпадает крайне важность в предварительном получении и очистке ферментов. К существенным недостаткам таких биосœенсоров можно отнести низкую селœективность определœения вследствие того, что клетки живых организмов фактически являются источником самых разнообразных ферментов. Помимо этого время отклика биосœенсоров на основе тканей и микроорганизмов может быть достаточно большим, что также уменьшает их практическую ценность. Тем не менее в последнее время наблюдается повышенный интерес к разработке конструкций электродов, содержащих не сами ферменты в очищенном виде, а их первозданные источники - биологические материалы. Так, было установлено, что тканевые срезы в биосœенсорах могут выполнять функцию источников каталитической активности. К примеру, создан биосœенсор на аскорбиновую кислоту, состоящий из платинового электрода и пластины кожуры огурца или тыквы, служащей источником аскорбиноксидазы. Активность фермента в такой природной матрице достаточна для проведения 50-80 определœений аскорбиновой кислоты в различных объектах. Установлено, что пластины биоматериала могут храниться без потери активности в течение года в 50%-ном глицеринœе.

Аналогичный подход использовали при создании конструкции биосœенсора на допамин - важнейший биогенный амин, участвующий в регуляции деятельности мозга. В данном биосœенсоре ткань плода банана была иммобилизована на поверхности кислородного электрода. В рассмотренных случаях биоматериалы создают "естественное окружение" для ферментов, способствующее стабилизации их активности. Тканевые материалы достаточно долго сохраняют высокую специфичность, что очень важно для биосœенсора, тогда как выделœенные ферменты в тех же условиях быстро разрушаются. Известны биосœенсоры, в которых использован цельный фрагмент ткани печени быка, являющийся носителœем фермента каталазы и иммобилизованный на кислородном электроде. Ферментативное действие каталазы, проявляющееся в катализе реакции разложения пероксида водорода, используют в этом случае для создания соответствующего электрода. Разработан биосœенсор на основе кожуры кабачка или огурца и кислородного электрода для определœения L-аскорбиновой кислоты во фруктовых соках, функционирующий подобно аналогичному типу электрода, уже рассмотренного выше. Тем не менее, несмотря на успехи в развитии биосœенсоров на основе биологических материалов, надежность их функционирования всœе еще остается спорной. Еще один пример конструкции биосœенсорного устройства относится к ферментному электроду на основе микроорганизмов - дрожжей, помещаемых между двумя пористыми мембранами. Биосœенсор на основе иммобилизованных дрожжей и кислородного электрода позволяет определять этанол и метанол, к примеру в промышленных стоках.

Интерес представляют биосœенсоры на основе иммобилизованных на мембране микроорганизмов, служащих элементом так называемого микробного сенсора. В качестве примера таких устройств можно упомянуть амперометрический сенсор на аммиак (в сточных водах) на основе иммобилизованных нитрифицирующих бактерий и кислородного электрода. Такой биосœенсор полезен при решении вопросов охраны окружающей среды, и в частности при контроле степени очистки промышленных стоков.

Можно отметить также использование биосœенсоров на основе гидролаз - ферментов, являющихся катализаторами гидролитического расщепления субстратов. Эти биосœенсоры предназначаются, как правило, для эколого-аналитического контроля остаточных количеств пестицидов класса фосфорорганических соединœений, а также для определœения некоторых ОВ. В случае если при гидролизе какого-либо субстрата ферментом класса гидролаз образуется электрохимически активное соединœение, то, контролируя содержание последнего, можно контролировать ферментативную реакцию аналогично тому, как в предыдущих случаях. При этом в присутствии веществ, являющихся ингибиторами, активность фермента уменьшается, что и обнаруживается по сигналу, регистрируемому электродом. Интересно отметить высокую чувствительность такого определœения: эффект изменения активности фермента доступен для измерения уже при действии ультраследовых количеств ингибитора - на уровне пико- и фемтограмм

Проблемы и перспективы развития

Концепция распознавания определяемого вещества с помощью иммобилизованного биоматериала оказалась плодотворной. В итоге исследователи приобрели новое средство, позволяющее быстро получить достоверную информацию о состоянии окружающей среды и здоровья человека. Некоторые биосœенсоры уже получают распространение для индивидуального использования в домашних аптечках (чаще всœего для определœения сахара в крови). Интерес к биосœенсорам непрерывно растет. В 1996 году состоялись четыре крупные международные конференции по биосœенсорам.

В случае если иметь в виду всœе разнообразие ферментов, присутствующих и действующих в живом организме и являющихся потенциальными биологическими преобразователями, то следует отметить, что существующее сегодня число конструкций биосœенсоров может быть увеличено в десятки и даже сотни раз. Биосœенсоры получают распространение в биотехнологии. Хотя здесь и встречаются трудности, связанные с невысокой термической устойчивостью предложенных устройств, приводящей к дезактивации биослоя, есть основания полагать, что данный недостаток будет в скором времени преодолен. Так, полагают, что для увеличения срока службы биосœенсоров в обозначенных выше условиях можно использовать ферменты, выделœенные из термофильных бактерий и одноклеточных водорослей - микроорганизмов, устойчивых к действию высоких температур. Определœенные трудности представляют собой также проблемы градуировки биосœенсоров и надежности их показаний. Для улучшения последнего показателя, в частности, предлагается использовать мультисенсорную систему, состоящую из ряда биочипов. Для получения определœенной "емкости" надежных данных производится расчет крайне важного числа таких датчиков. При этом в целом так называемые метрологические характеристики биосœенсоров вполне приемлемы. Относительное стандартное отклонение определяемой концентрации не выше 10-12 %, притом что нижняя граница определяемых содержаний достигает 10-15 моль/л. Некоторые биосœенсоры работают по принципу да-нет, что вполне приемлемо, когда решается вопрос о присутствии ультрамалых количеств высокотоксичных веществ в объектах окружающей среды. В случае если определяемые компоненты находятся в сложной смеси или матрице или же близки по своим свойствам, то при анализе используют хроматографические методы разделœения. Контроль за разделœением осуществляют с помощью системы детекторов на основе биосœенсоров. И здесь получены поразительные результаты: разделяют и количественно определяют оптические активные изомеры, различные сахара (лактозу, фруктозу, глюкозу и т.д.), сложные по структуре биологически активные соединœения и т.п.

Вот один из недавних примеров разработки биосœенсоров, основанных на использовании природного хеморецептора. Хеморецептор, извлеченный из чувствительных антенн (органелл) голубого морского краба, был прикреплен к ультрамикроэлектроду, измеряющему потенциал. В результате был изготовлен новый тип потенциометрического детектора, чрезвычайно быстро реагирующего на ничтожные изменения состава среды, в которую он погружен. Сам голубой краб очень чувствителœен к следам тяжелых металлов и живет только в чистейшей морской воде.

На очереди создание биосœенсоров, заменяющих рецепторы живых организмов, что позволит создать "искусственные органы" обоняния и вкуса, а также применить указанные разработки для возможно более точной и информативной диагностики ряда заболеваний. Несомненно, что в ближайшем будущем в этой смежной области биологии и химии следует ожидать новых открытий.


Литература

1.   Биосœенсоры: основы и приложения / Под ред. Э. Тернера и др. М.: Мир, 1992. 614 с.

2.   Будников Г.К., Майстренко В.Н., Муринов Ю.И. Вольтамперометрия с модифицированными и ультрамикроэлектродами. М.: Наука, 1994. 239 с.

3.   Будников Г.К., Медянцева Э.П., Бабкина С.С. // Успехи химии. 1991. Т. 60. С. 881.

 

                                  


Настоящее и будущее биосенсоров - 2020 (c).
Яндекс.Метрика