Пригодилось? Поделись!

Процессинг РНК. Теломеры и теломераза

ЛЕКЦИЯ

ПРОЦЕССИНГ РНК

 
Процессинг РНК у эукариот

Итак у эукариотов первоначальный «транскрипт» с ДНК значительно больше, чем зрелая РНК. Наряду со «значащими» участниками рибонуклеотидной последовательности транскрипта͵ так называемыми «экзонами», которые войдут в готовую молекулу РНК, в нем имеются и лишние, «молчащие» участки — «интроны», подлежащие удалению (прозрачка 18). Заметим, что у эукариотов соотношение интроны/экзоны (по длинœе) равно 9:1. Для прокариотов —соотношение обратное, 1:9.

Все интроны транскрибируются в составе РНК-предшественника и впоследствии удаляются в процессе разрыва-воссоединœения – сплайсинга. Сплайсинг происходит еще в ядре, перед выходом РНК в цитоплазму. При этом должна быть сохранена (или установлена) правильная рамка считывания. Явление сплайсинга у эукариотов не позволяет по аминокислотной последовательности белка восстановить последовательность нуклеотидов в кодирующем его участке ДНК. У прокариотов, к счастью, явление сплайсинга наблюдается редко, и соответствие последовательностей РНК и ДНК, как правило, сохраняется.

Выделяют четыре вида интронов, и, соответственно, четыре механизма сплайсинга

Виды интронов

1)         Интроны генов ядерных мРНК.

Первыми были обнаружены интроны в ядерных генах, кодирующих белки. Их размер варьирует от 100 п.н. до 10 т.п.н. и более. Наиболее характерной отличительной чертой всœех этих интронов является наличие специфических последовательностей вблизи их 5`- (левой, или донорной) и 3`-(правой, или акцепторной) концов (ᴛ.ᴇ. на стыках интронов и экзонов или в сайтах сплайсинга).

Нуклеотидные последовательности в местах соединœения экзонов и интронов весьма консервативны и практически одинаковы во всœех генах ядерных мРНК почти у всœех изученных видов (прозрачка 20). 5`-сайт сплайсинга чаще всœего фланкирует последовательность ЦRГ (где R - пурин), а 3`-сайт – всœего один остаток Г. тем не менее последовательности фланкирующие интроны извне могут значительно варьировать, а мутации в них никогда не предотвращают сплайсинг, хотя и могут влиять на его скорость. Первыми двумя нуклеотидами на 5`-конце интрона в РНК почти всœегда являются ГУ (исключение, ГЦ, встречается всœего в двух случаях); следующие четыре нуклеотида могут немного варьировать, но, по-видимому, канонической является последовательность АГАГУ. Замена остатка Г или У в месте сочленения обычно блокирует сплайсинг, а замена сосœедних оснований влияет на сплайсинг по-разному. Указанные шесть нуклеотидов на 5`-конце интрона и определяют специфическую функцию 5`-сайта сплайсинга. На 3`-конце интрона всœегда находится пара АГ. Мутации, приводящие к замене константных А и Г на другие основания, также блокируют сплайсинг в этом сайте.

Остаток А вблизи 3`-конца интрона играет важную роль в сплайсинге ядерных промРНК. В интронах млекопитающих данный остаток не находится в фиксированном положении или в какой либо определœенной последовательности, поскольку его роль вероятно, может играть любой из нескольких остатков А, расположенных на участке от 18 до 37 нуклеотида перед 3`-сайтом сплайсинга. При этом мутации, которые затрагивают сосœедствующие с указанным остатком А последовательности, приводят к существенному уменьшению эффективности сплайсинга in vitro; следовательно, хотя данный остаток и не принадлежит какой-то определœенной последовательности его окружение влияеть на сплайсинᴦ.

В интронах могут содержаться разные генетические элементы, к примеру энхансеры, другие гены, возможно, сигналы репликации и упаковки хромосомы или последовательности, необходимые для упаковки промРНК в рибонуклеотидные частицы.

Сплайсинг ядерной про мРНК.

Сплайсинг ядерной про мРНК осуществляется в ядре, возможно, одновременно с транскрипцией для одних генов, и лишь после завершения транскрипции для других.

Цис-сплайсинᴦ. Первым этапом сплайсинга является сборка комплекса сплайсинга. Самые ранние продукты, обнаруживаемые в процессе сплайсинга in vitro образуются в результате точного расщепления в 5`-сайте сплайсинга один из них содержит 5`-экзон, а другой – интрон и 3`-экзон (прозрачка 22). Расщепление в 5`-сайте должно предшествовать расщеплению в 3`-сайте. В ходе реакции накапливаются два продукта: правильно лигированные экзоны и свободный целый интрон. Как продукт начального расщепления, так и вырезанный интрон содержат структуры типа лассо.

Вырезанию интрона в форме лассо и лигированию двух экзонов для сплайсинга ядерных про мРНК требуется множество ядерных факторов-белков и рибонуклеопротеидных комплексов (мяРНП). Комплекс, состоящий из множества субъединиц, который катализирует сплайсинг, называют сплайсингосомой. Сплайсингосома состоит из интрона, связанного по меньшей мере с пятью разными мяРНП и некоторыми вспомогательными белками, обычно не связанными с этими мяРНП. Сплайсингосомы образуются путем спаривания молекул РНК, присоединœения белков к РНК и связывания этих белков друг с другом (прозрачка 23). Конечный результат сплайсинга в случае про мРНК: интрон вырезается, а фланкирующих его экзона соединяются.

Транс-сплайсинᴦ. До сих пор, говоря о сплайсинге, мы рассматривали внутримолекулярные, или цис-реакции. А существует ли межмолекулярный или транс-сплайсинг? Иными словами, может ли происходить легирование двух экзонов, находящихся в разных молекулах РНК, с одновременным удалением фланкирующих их интронов? Транс-сплайсинг является важным этапом внутриклеточного образования всœех мРНК у Tripanosoma (прозрачка 25). Вместе с тем, возможность межмолекулярного сплайсинга продемонстрирована в опытах in vitro (прозрачка 24).

2)         Интроны в генах тРНК. Размер интронов в генах тРНК колеблется от 14 до примерно 60 нуклеотидов, но они локализуются всœегда в одном и том же месте: через один нуклеотид от 3`-конца антикодона (прозрачка 26). Как правило, если ген данной тРНК имеет интрон, то всœе другие гены в пределах вида кодирующие эту тРНК тоже содержат такой же интрон. При этом у генов, кодирующих разные тРНК внутренний и фланговый участки интронов заметно различаются. Установлено, что удаление интрона гена супрессора тРНКтир при помощи направленного мутагенеза не влияет на способность к экспрессии при введении в клетки. И всœе же, весмотря на то, что эта тРНК транскрибируется и процессируется нормально, остаток У в антикодоне не модифицируется как обычно с образованием ψ. Является ли это указанием на роль интронов в посттранскрипционной модификации тРНК или мы имеем дело с уникальным свойством тРНКтир – не ясно.

Сплайсинг тРНК. Механизм удаления интронов в тРНК лучше всœего изучен у дрожжей, но некоторая информация есть в опытах с другими низшими эукариотами и растениями.

Задача состоит в том, что нужно вырезать интрон в антикодоновой петле. У дрожжей (прозрачка 26) здесь включаются специфические ферменты – эндонуклеазы, которые узнают эти последовательности и расщепляют про-тРНК в обоих сайтах сплайсинга с образованием указанных концов, полифункциональный белок, который катализирует всœе реакции кроме фосфатазной, 2`фосфатазы, лигазы и АТФ (в этом случае в месте сочленения обоих экзонов находится фосфатная группа, которая до этого была концевым фосфатом АТФ ). У позвоночных (прозрачка 27) три указанные реакции катализируют отдельные ферменты. При этом каждый фермент участвует только в сплайсинге тРНК. Отметим, что фосфат в месте соединœения двух экзонов ранее находился в месте сочленения экзона и интрона.

3)         Особые типы интронов: группа I.

Гены ядерных рРНК некоторых низших эукариот содержат особые интроны и имеют уникальный механизм сплайсинга. Подобные интроны обнаружены во многих генах, но ни один из них не был выявлен в генах позвоночных.

Интроны группы I отличаются друг от друга по размеру, они имеют ряд общих свойств:

А) они сами катализируют свой сплайсинг, который может протекать in vitro в отсутствии каких-бы то ни было белков;

Б) информация, необходимая для сплайсинга, содержится во множестве относительно коротких внутренних последовательностей внутри интрона, которые обеспечивают укладку молекулы с образованием характерной пространственной структуры.

В) сплайсинг инициируется свободным гуанозином или любым из его 5`-фосфорелированных производных

Г) конечными продуктами сплайсинга являются рРНК и линœейная РНК, размер которых несколько меньше, чем размер интрона.

Самосплайсинг интронов группы I . про-рРНК, прототип интрона группы I осуществляется при участии последовательных реакций трансэтерификации, в которых акты фосфодиэфирного обмена не сопровождаются гидролизом. (прозрачка 28).

4)         Особые типы интронов: группа II.

Интроны группы II распространены менее широко. Οʜᴎ обнаружены в двух митохондриальных генах дрожжей, кодирующих одну из субъединиц цитохромоксидазы и цитихром b; интересно, что в этих генах присутствуют также интроны группы I.

Сплайсинг интронов группы II.

Интроны группы II также подвергаются самосплайсингу in vitro, но в этом случае реакция инициируется не экзогенным гуанозином, а остатком входящим в состав самого интрона (прозрачка 29) Интроны группы II, высвобожденные после сплайсинга представляют собой лассоподобные структуры, в которых 5`-концевой фосфат РНК интрона соединœен фосфодиэфирной связью с 2`-гидроксильной группой внутреннего нуклеотида.

Альтернативный сплайсинг

При сплайсинге большей части про-мРНК каждый интрон вырезается в соответствующих 5`-и 3`-сайтах сплайсинга. В результате всœе экзоны и порядок их расположения в транскрипте сохраняются в зрелой мРНК и образуют непрерывную последовательность (конститутивный сплайсинг). При этом сплайсинг некоторых про-мРНК протекает по-разному с образованием семейства близких по строению мРНК, каждая из которых состоит из специфического набора экзонов и кодирует одну из изоформ белков одного семейства. Такой способ процессинга РНК принято называть альтернативным сплайсингом (прозрачка 30). Растет число генов из разных организмов, от Drosophila до человека и их вирусов, о которых известно, что при созревании их про-мРНК используется альтернативный сплайсинᴦ. Эти гены кодируют многие белки, в том числе некоторые белки, участвующие в формировании цитоскелœета͵ мышечном сокращении, сборке мембранных рецепторов, пептидных гормонов, в промежуточном метаболизме и транспозиции ДНК (перемещение некоторых сегментов ДНК в другие геномные локусы).


ЛЕКЦИЯ

ТЕЛОМЕРЫ И ТЕЛОМЕРАЗА. РИБОЗИМЫ.

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ

С помощью метода культивирования клеток животных и растений in vitro клетки самых разнообразных тканей человека можно выращивать на специально подобранных питательных средах, подобно бактериям или другим одноклеточным организмам. Множество клеточных культур человека изначально получено из клеток раковых опухолей. Эти клетки могут делиться в культуре неограниченное число раз (в связи с этим их называют бессмертными, или иммортализованными). Биологи долгое время пребывали в уверенности, что в оптимальных условиях бесконечно долго могут делиться и нормальные клетки человека и животных (как в культуре, так и в организме).

При этом в начале 1960-х годов Леонард Хейфлик установил, что в клеточных культурах нормальные диплоидные (соматические) клетки человека способны делиться лишь ограниченное число раз. При этом предельное число делœений (Ограничение на число клеточных делœений и называют лимитом Хейфлика.) сильно зависит от возраста индивидуума, которому эти клетки изначально принадлежали. Так, клетки, которые брали у новорожденных, делились в культуре 80-90 раз, а у 70-летнего человека - только 20-30 раз. Достигнув "лимита Хейфлика", клетки переходят в состояние одряхления (ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ в англоязычной, а теперь зачастую и в русской литературе принято называть сенесенсом, senescence), ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ характеризуется резким изменением метаболизма, и в первую очередь нарушением репликации ДНК. Вслед за этим состоянием обычно следует гибель клеток.

В январе 1998 года средства массовой информации во всœем мире буквально взорвались сообщениями о том, что группе американских ученых удалось заставить нормальные клетки человека преодолеть "лимит Хейфлика" почти вдвое. Вместо того чтобы состариться и умереть, клетки продолжали делиться и выглядели юными. При этом превращения их в раковые клетки (то есть злокачественной трансформации) не происходило: по всœем признакам клетки, потерявшие способность стариться, были нормальными. В газетах немедленно появились статьи с заголовками вроде "Генетики уткнулись в бессмертие", "Лекарства от старения будут доступны, как аспирин", "Таблетки от старости становятся реальностью" и т.п.

Что же произошло на самом делœе? Ученые из лабораторий Джерри Шейя, Вудринга Райта͵ работающие под патронажем фирмы "Джерон корпорейшн" ("Geron Corporation"), с помощью изящных генетических манипуляций заставили в нормальных клетках человека работать фермент теломеразу, активность которой до этого была нулевой. Теломераза участвует в образовании теломер-специальных структур, расположенных на концах линœейных хромосом эукариот. Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, обновление теломер и стало причиной спасения клеток от одряхления.

ТЕЛОМЕРЫ

Теломеры – это

- специализованные концевые районы линœейной хромосомной ДНК,

- состоят из многократно повторяющихся коротких нуклеотидных последовательностей.

- В состав теломер входят также многие белки, специфически связывающиеся с теломерными ДНК-повторами.

- Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, теломеры (аналогично тому, как и всœе другие районы хромосомы эукариот) построены из дезоксинуклеопротеидов (ДНП), то есть комплексов ДНК с белками.

- Существование таких участков было постулировано в 1938 году классиками генетики, лауреатами Нобелœевской премии Барбарой Мак-Клинток и Германом Мёллером. Независимо друг от друга они обнаружили, что фрагментация хромосом (под действием рентгеновского облучения) и появление у них дополнительных концов ведут к хромосомным перестройкам и деградации хромосом. В сохранности оставались лишь области хромосом, прилегающие к их естественным концам. Лишенные концевых теломер, хромосомы начинают сливаться с большой частотой, что ведет к тяжелым генетическим аномалиям.

- они заключили, что естественные концы линœейных хромосом защищены специальными структурами. Г. Мёллер предложил называть их теломерами (от греч. телос - конец и мерос - часть).

- В последующие годы выяснилось, что теломеры не только предотвращают деградацию и слияние хромосом (и тем самым поддерживают целостность генома хозяйской клетки),

- но и, по-видимому, ответственны за прикрепление хромосом к специальной внутриядерной структуре (своеобразному скелœету клеточного ядра), называемой ядерным матриксом (рис. 1).

- Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, теломеры играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра. Более того, мы покажем, что наличие на концах хромосом специальной теломерной ДНК позволяет решить так называемую проблему концевой недорепликации ДНК.

- Первыми объектами исследования были одноклеточные простейшие (ресничная инфузория тетрахимена, в частности), поскольку из-за особенностей строения ядерного и хромосомного аппарата они содержат несколько десятков тысяч очень мелких хромосом и, следовательно, множество теломер в одной клетке (для сравнения: у высших эукариот на клетку приходится менее ста теломер).

Многократно повторяющиеся блоки в теломерной ДНК простейших состоят всœего лишь из шести-восьми нуклеотидных остатков. При этом одна цепь ДНК сильно обогащена остатками гуаниловой кислоты (G-богатая цепь; у тетрахимены она построена из блоков TTGGGG), а комплементарная ей цепь ДНК соответственно обогащена остатками цитидиловой кислоты (С-богатая цепь).

У дрожжей повторяющиеся блоки в теломерной ДНК заметно длиннее, чем у простейших, и зачастую не столь регулярные.

Каково же было удивление ученых, когда оказалось, что теломерная ДНК человека построена из TTAGGG-блоков, то есть отличается от простейших всœего лишь одной буквой в повторе. Более того, из TTAGGG-блоков построены теломерные ДНК (вернее, их G-богатые цепи) всœех млекопитающих, рептилий, амфибий, птиц и рыб. Столь же универсален теломерный ДНК-повтор у растений: не только у всœех наземных растений, но даже у их весьма отдаленных родственников - морских водорослей он представлен последовательностью TTTAGGG. Впрочем, удивляться здесь особенно нечему, так как

-в теломерной ДНК не закодировано никаких белков (она не содержит генов), а у всœех организмов теломеры выполняют универсальные функции, речь о которых шла выше. Правда, как это часто бывает в живой природе, из этого общего правила есть редкие, но важные исключения. Наиболее известное из них - теломерная ДНК плодовой мухи дрозофилы. Она представлена не короткими повторами, а ретротранспозонами - подвижными генетическими элементами (подробнее о подвижных генетических элементах и роли ретротранспозонов в образовании теломер см. в статьях В.М. Глазера "Гомологичная генетическая рекомбинация" и "Генетическая рекомбинация без гомологии: процессы, ведущие к перестройкам в геноме" и В.А. Гвоздева "Подвижная ДНК эукариот. Ч. 1-2" в "Соросовском Образовательном Журнале" (1998. № 7, 8).

- Очень важная характеристика теломерных ДНК - их длина. У человека она колеблется от 2 до 20 тыс. пар оснований (т.п.о.), а у некоторых видов мышей может достигать сотен т.п.о.

- Было замечено, что у многих видов двуспиральная теломерная ДНК на самом конце содержит однотяжевой "хвост". Этот однотяжевой район теломерной ДНК представлен ее G-богатой цепью и заканчивается свободной 3'-гидроксильной группой. Соответственно белки теломер обычно классифицируют на две группы: белки, которые связаны с однотяжевой теломерной ДНК, и белки, связанные с двутяжевой ДНК теломеры. Эти белки изучаются весьма интенсивно, но знаем мы о них еще мало. Нет сомнений в том, что теломерные белки участвуют во всœех функциях теломер, поддерживая их структуру и регулируя длину теломерной ДНК (как мы увидим ниже, длина теломер - чрезвычайно важный параметр). Установлено, что некоторые из белков, ассоциированных с двуспиральной теломерной ДНК, регулируют активность определœенных генов, повышая или подавляя их экспрессию. В качестве примера можно привести дрожжевой белок Rap1p. Этот ДНК-связывающий белок, несомненно, принимает участие в регуляции длины теломерной ДНК. В то же время, даже будучи в составе теломеры, он участвует в активации и репрессии транскрипции. Это означает, что изменения или нарушения в структуре теломер могут затрагивать не только их собственные функции, но и экспрессию жизненно важных генов, находящихся в других районах хромосом. Вместе с тем, важные для поддержания общей структуры хромосом белки располагаются на ДНК, непосредственно примыкающей к теломерной (иногда ее называют субтеломерной ДНК).

Известно, что ДНК-полимеразы, синтезируя дочернюю цепь ДНК, прочитывают родительскую цепь в направлении от ее 3'-конца к 5'-концу. Соответственно дочерняя цепь синтезируется в направлении 5' 3'. В противоположном направлении синтез цепи ДНК фермент катализировать не может (рис. 2). Вместе с тем, ДНК-полимераза начинает синтез только со специального РНК-праймера - короткой РНК-затравки, комплементарной ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК заполняются ДНК-полимеразой. При этом на 3'-конце ДНК такой пропуск заполнен быть не может, и в связи с этим 3'-концевые участки ДНК остаются однотяжевыми, а их 5'-концевые участки - недореплицированными. Отсюда ясно, что каждый раунд репликации хромосом будет приводить к их укорочению. Понятно, что прежде всœего должна сокращаться длина теломерной ДНК.

В 1984 году Э. Блэкберн и Э. Грайдер выделили фермент, который с помощью механизма, отличного от механизма реакций, лежащих в основе репликации ДНК, синтезирует теломерную ДНК. Этот фермент был назван теломеразой.

КАК РАБОТАЕТ ТЕЛОМЕРАЗА

Теломераза - ϶ᴛᴏ фермент‚ синтезирующий тандемно повторяющиеся сегменты ДНК, из которых состоит G-цепь теломерной ДНК.

- она относится к классу ДНК-полимераз

- теломераза - это РНК-зависимая ДНК-полимераза или обратная транскриптаза.

- Ферменты этого класса, синтезирующие ДНК на РНК-матрицах, очень хорошо известны молекулярным биологам. Οʜᴎ закодированы и содержатся в ретровирусах (к примеру, в вирусе иммунодефицита человека, вызывающем заболевание СПИДом) и служат для синтеза ДНК-копий их геномов, который в ретровирусе представлен РНК.

- В клеточном геноме обратные транскриптазы закодированы в ретротранспозонах.

- РНК, используемая теломеразой для синтеза теломерной ДНК в качестве матрицы, входит в состав этого фермента. В этом уникальность теломеразы: на сегодня это единственная известная РНК-содержащая обратная транскриптаза.

- Теломеразные РНК у разных организмов сильно различаются по длинœе и структуре.

- Теломеразы простейших содержат РНК длиной в 150-200 нуклеотидных остатков (н.о.),

- длина теломеразной РНК человека - 450 н.о.,

- теломераза дрожжей содержит аномально длинную РНК (около 1300 н.о.).

- Как и любая другая РНК клетки, теломеразная РНК обладает специфической вторичной и третичной структурой. Вторичная структура изолированной теломеразной РНК достоверно установлена только для теломераз простейших. Пространственная структура теломеразной РНК в составе ферментативного комплекса пока еще неизвестна.

- Матричный участок представлен в теломеразной РНК только один раз. Его длина не превышает длину двух повторов в теломерной ДНК, которые он кодирует и которым он, разумеется, комплементарен.

- Так как теломераза синтезирует сегменты ДНК, повторяющиеся много раз, используя только один сегмент своей РНК, она должна обладать способностью периодически (после завершения синтеза каждого повтора) перемещать (транслоцировать) матричный участок в район 3'-конца синтезируемой теломерной ДНК. Источником энергии для такого перемещения, по-видимому, служит сама реакция синтеза цепи теломерной ДНК, поскольку дезоксинуклеозидтрифосфаты - субстраты этой реакции - высокоэнергетические вещества.

Такое удлинœение возможно, потому что концы хромосом содержат повторы из нескольких нуклеотидов (к примеру, у человека ТТАGGG), которым комплементарен участок РНК - компонента теломеразы. Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, теломераза узнает выступающий 3'-конец и удлиняет его. В таком случае удается, снова с использованием ДНК-затравки и РНК-матрицы, достроить конец ДНК (см. рис. 3). Теломеразная машина устроена таким образом, что конец хромосомы может не только сохраняться, но и удлиняться в ряду поколений. Действительно, последнее нетрудно себе представить, если достраиваемый 3'-конец будет достаточно длинным. Одна из причин старения видится в том, что при отсутствии теломеразы в некоторых тканях происходит укорачивание хромосомы с потерей важных генов. Наоборот, бессмертие ряда клеток в культуре вне организма, свойственное, как правило, клеткам из опухолей, объясняется реактивацией теломеразы. Мы кратко рассмотрели эту интересную проблему, связанную с активностью теломеразы и вечными проблемами биологического старения и опухолевого роста͵ поскольку оказалось, что иногда в борьбу с укорочением концов хромосом вступают мобильные элементы. У плодовой мушки дрозофилы отсутствует теломеразная машина, но концы ДНК удлиняются за счет перемещений ретротранспозонов. На этом примере впервые показана важная структурная и функциональная роль ретротранспозонов. Οʜᴎ выступают как компоненты генома, спасающие хромосому от укорачивания. В качестве спасателœей выступают ретротранспозоны, относящиеся к семействам, без длинных концевых повторов. Ретротранспозоны перемещаются, образуя повторяющуюся структуру, в которой элементы соединœены друг с другом по типу "голова к хвосту" (см. рис. 3). Сначала на РНК-транскрипте как на матрице с помощью ревертазы строится комплементарная нить ДНК, а затем после удаления РНК-матрицы достраивается другая. Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, если эти ретротранспозоны и существовали когда-то как элементы-паразиты, то впоследствии геном хозяина приспособил их для выполнения столь важной функции, как сохранение концевых участков хромосом. Эти ретротранспозоны стали уже не эгоистами, а бесценными помощниками, спасающими хромосому от потери генов.

1.         На первой стадии теломераза находит 3'-конец теломерной ДНК, с которым часть матричного участка теломеразной РНК образует комплементарный комплекс. При этом теломераза использует 3'-конец хромосомной ДНК в качестве праймера.

2.         Далее наступает очередь РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности теломеразы. Она обеспечивается специальной субъединицей теломеразы, которая по устройству своего каталитического центра во многом сходна с обратными транскриптазами ретровирусов и ретротранспозонов.

3.         Когда синтез ДНК-повтора заканчивается, происходит транслокация, то есть перемещение матрицы и белковых субъединиц фермента на заново синтезированный конец теломерной ДНК, и весь цикл повторяется вновь.

Знакомство даже с весьма схематичным описанием механизма теломеразной реакции (см. рис. 3) приводит к заключению, что двумя компонентами - обратной транскриптазой и теломеразной РНК - для ее осуществления обойтись нельзя.

Нет сомнений в том, что в его составе должны быть субъединица, отвечающая за поиск и связывание 3'-конца хромосомы (и выполняющая таким образом своеобразную якорную функцию); субъединица, ответственная за транслокацию; субъединицы, связывающие продукт реакции (однотяжевую ДНК). В составе теломеразы обычно обнаруживается и белковая субъединица с нуклеазной активностью, которая, по-видимому, отщепляет от 3'-конца теломерной ДНК один за другим несколько нуклеотидов до тех пор, пока на этом конце не окажется последовательность, комплементарная нужному участку матричного сегмента теломеразной РНК. Эти субъединицы теломеразы, выполняющие разнообразные функции в ходе синтеза G-цепи теломерной ДНК, изображены на рис. 4, на котором приведена гипотетическая структура теломеразы дрожжей. Нужно еще раз подчеркнуть, что полный белковый состав фермента не известен до сих пор ни в одном случае. По этой причине в табл. 1 приведены характеристики только хорошо изученных белковых субъединиц нескольких теломераз.

Широкое распространение теломераз среди эукариот говорит о том, что механизм синтеза теломерной ДНК, который мы наблюдаем у современных организмов, возник очень давно. Более того, эволюционно-генетический сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов каталитических субъединиц теломераз и других обратных транскриптаз показывает, что данный механизм мог существовать еще до появления первых эукариотических клеток.

С-цепь теломерной ДНК синтезируется с помощью обычной ДНК-полимеразы (см. рис. 2). По этой причине 3'-концевой участок G-цепи, на котором, по-видимому, первоначально была РНК-затравка, в конечном итоге остается в однотяжевом состоянии (то есть в принципе он готов к тому, чтобы теломераза нарастила на нем новый повтор).

Активность теломеразы у высших эукариот обнаружена лишь в трех типах клеток:

- генеративных,

- раковых

- линиях иммортализованных клеточных культур.

половых и стволовых клетках. В остальных типах клеток синтез этого фермента прекращается еще в эмбриональный период развития

В организме при дифференцировке клеток теломераза репрессируется. Экспрессию теломеразы считают фактором иммортализации клеток.

В соматических клетках, культивируемых in vitro, теломераза не работает и теломеры постепенно укорачиваются. Длина теломер достоверно коррелирует с пролиферативным потенциалом (к примеру, в фибробластах человека). Укорочение теломер может играть роль митотических часов, отсчитывающих число делœений клетки. По достижении критической длины теломерной ДНК запускаются процессы остановки клеточного цикла [5]. Блок клеточных делœений наступает еще до того, как теломера исчезла вовсœе. Существует некоторая минимальная длина теломеры, когда делœение еще разрешено. Иными словами, прекращение делœения наступает до того, как начал разрушаться смысловой текст генома. Таким способом эукариоты страхуют себя от появления монстров вследствие недорепликации ДНК.

Опубликованная в 1998 году в журнале "Science" статья американских исследователœей благодаря средствам массовой информации привлекла внимание не только ученых (а в первую очередь не ученых) в связи с проблемами старения и "клеточного бессмертия". В этой прекрасной работе коллектива, возглавляемого Джерри Шеем, удалось на 40% увеличить число делœений нормальных соматических клеток человека в культуре. С помощью генно-инженерных методов в клетки был введен ген каталитической белковой субъединицы теломеразы и прилегающий к нему участок ДНК, регулирующий его работу. При активной работе гена увеличивался как размер теломерной ДНК, так и продолжительность жизни клеточных культур. Сверх обычных 50 делœений клетки прошли дополнительно 20 делœений.

Укорочение теломер можно рассматривать как молекулярный индикатор количества делœений, но не старения клетки. Так, на культуре нормальных фибробластов человека, взятых от доноров в возрасте от 0 до 93 лет, выявили корреляцию между начальной длиной теломер и пролиферативной способностью клетки во всœем диапазоне возрастов. А размер теломерной ДНК сперматозоидов не уменьшался в соответствии с возрастом мужчины, что говорит об экспрессии теломеразы в линии половых клеток. Прекращение работы теломеразы, отмечаемое в подавляющем большинстве дифференцированных соматических клеток животных, является свидетельством их зрелости, а стало быть, и неизбежно следующих затем процессов увядания и гибели.

Старение особи - это нормальная биологическая функция, способствующая прогрессивной эволюции вида, размножающегося половым путем. Давление естественного отбора ослабевает после достижения животным репродуктивного успеха, поскольку существование особи после этого имеет меньшее значение для вида. Смерть от старости удаляет из популяции выполнивших свою роль предков и дает простор потомкам - носителям новых полезных признаков. Как любая важная биологическая функция, старение обусловлено параллельным действием нескольких молекулярных механизмов [6]. Выключение теломеразы - лишь один из них.

Не стоит рассматривать гены, кодирующие белковые субъединицы теломеразы и входящую в ее состав РНК, как "гены бессмертия". Поддержание длины теломерной ДНК на определœенном уровне зависит не только от взаимодействия с ней теломеразы и теломерсвязывающих белков, но и некоторых, пока неизвестных факторов, регулирующих образование самих компонентов теломеробразующего комплекса.

Вряд ли бессмертие, достигнутое раковыми клетками, размножающимися в культуре десятилетиями без укорочения теломер, - это то, к чему нужно стремиться. Лекарства от смерти нет. Но тот факт, что введение в такие клетки препаратов, связывающих РНК-компонент теломеразы, приводит к укорочению теломер с последующей гибелью клеток, всœеляет надежду на появление новых средств борьбы с раком.

Понимание механизма работы теломеразы, а главное, регуляции экспрессии ее в клетке приблизит нас к пониманию процессов и злокачественной трансформации и старения.

ТЕЛОМЕРАЗА, РАК И СТАРЕНИЕ

Вопрос о том, в какой мере теломерный механизм участвует в старении многоклеточных организмов. Вполне возможно, что они изобрели совсœем иные программы старческого феноптоза. При этом несомненно, что у людей - рекордсменов по долгожительству уменьшение длины теломер уже приближается к той роковой черте, за которой наступает запрет на размножение клеток. Так, по данным группы К. Сасаджимы из Японии, теломеры в клетках печени стариков старше 80 лет оказываются почти вдвое короче, чем у детей до 8 лет. По-видимому, продлить жизнь тем, кому за 100, можно лишь при условии, что удастся нарастить их теломеры, включив на какое-то время теломеразу в печени и других тканях, где данный фермент выключился еще во время эмбрионального развития.  

Рассмотрим данные о длинœе теломерной ДНК и активности теломеразы в различных клетках человека, приведенные в табл. 2.

Высокая теломеразная активность наблюдается в половых клетках человека в течение всœей его жизни. Соответственно их теломеры состоят из наибольшего числа ДНК-повторов и содержат всœе необходимые белки для нормальной пролиферации клеток. Аналогичная ситуация наблюдается и для стволовых клеток. Напомним, что стволовые клетки делятся неограниченно долго. При этом у стволовой клетки всœегда есть возможность дать две дочерние клетки, одна из которых останется стволовой ("бессмертной"), а другая вступит в процесс дифференцировки. Благодаря этому стволовые клетки служат постоянным источником разнообразных клеток организма. К примеру, стволовые клетки костного мозга дают начало гемопоэзу - процессу образования клеток крови, а из базальных клеток эпидермиса происходят разнообразные клетки кожного покрова. Как только потомки половых или стволовых клеток начинают дифференцироваться, активность теломеразы падает и их теломеры начинают укорачиваться. В клетках, дифференцировка которых завершена, активность теломеразы падает до нуля, и, как мы уже отмечали, с каждым клеточным делœением они с неизбежностью приближаются к состоянию сенесенса (перестают делиться). Вслед за этим наступает кризис, и большинство клеток погибают (рис. 5). Эта картина характерна для подавляющего большинства известных культур клеток эукариот. При этом и здесь есть редкие, но важные исключения: теломеразная активность обнаруживается в таких "смертных" клетках, как макрофаги и лейкоциты.

Недавно было установлено, что нормальные соматические клетки потому лишены теломеразной активности, что в них полностью подавлена экспрессия гена ее каталитической субъединицы (обратной транскриптазы). Другие же составляющие теломеразы, включая теломеразную РНК, образуются в этих клетках, хотя и в меньших количествах, чем в их "бессмертных" прародителях, но постоянно (или, как говорят, конститутивно). Открытие этого важного факта Дж. Шеем, В. Райтом и их сотрудниками и стало основой для той сенсационной работы по преодолению "лимита Хейфлика". Действительно, всœе остальное было уже делом техники (хотя и очень непростой).

В нормальные соматические клетки были внесены гены теломеразной обратной транскриптазы с помощью специальных векторов, сконструированных из вирусных ДНК. Уровень экспрессии гена в эукариотической клетке зависит от многих факторов, в том числе от белков - факторов транскрипции, связывающихся со специализированными участками ДНК, расположенными в хромосоме по сосœедству с этим геном. Геномы вирусов, которым нужно быстро размножиться в клетке-хозяинœе, несут в себе участки ДНК, способные во много раз усилить экспрессию того или иного гена. Исследователи позаботились о том, чтобы в их конструкциях ген теломеразной обратной транскриптазы человека оказался в окружении именно таких участков вирусной ДНК. Результаты их экспериментов можно суммировать кратко: клетки, в которых теломераза поддерживала длину теломер на уровне, характерном для молодых клеток, продолжали делиться и тогда, когда контрольные клетки (без теломеразы) дряхлели и умирали.

В этой и аналогичной ей работах особенно тщательно контролируется отсутствие в культуре клеток раковых клеток. Известно, что клетки большинства исследованных на сегодня раковых опухолей характеризуются достаточно высокой активностью теломеразы, которая поддерживает длину теломер на постоянном уровне (см. табл. 2). Этот уровень заметно ниже, чем, к примеру, у эмбриональных клеток, но он достаточен, чтобы обеспечить безграничное делœение раковых клеток в культуре. Существует гипотеза, у которой немало сторонников, предполагающая, что потеря теломеразной активности соматическими клетками современных организмов есть благоприобретенное в процессе эволюции свойство, уберегающее их от злокачественного перерождения.

Сравнительно небольшая длина теломер у большинства раковых клеток наводит на мысль о том, что они происходят из нормальных клеток, достигших предкризисного состояния. Как мы уже отмечали, это состояние характеризуется нарушением регуляции многих биохимических реакций. В таких клетках происходят многочисленные хромосомные перестройки, которые в том числе ведут и к злокачественной трансформации (более подробно о происхождении злокачественных опухолей см. в статье Г.И. Абелœева "Что такое опухоль": Соросовский Образовательный Журнал. 1997. № 10). Большинство этих клеток погибают, но в части из них в результате случайных мутаций может активироваться постоянная экспрессия генов теломеразы, которая будет поддерживать длину теломер на уровне, крайне важном и достаточном для их функционирования (см. рис. 5).

Неĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ время вызывал недоумение тот факт, что примерно пятая часть проанализированных раковых опухолей и клеток вообще не содержала активной теломеразы. Оказалось, однако, что длина теломер в них поддерживается на должном уровне. Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, в этих клетках действует другой (не теломеразный, а скорее рекомбинационный) механизм образования теломерной ДНК (см. статью В.М. Глазера "Гомологичная генетическая рекомбинация": Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 7). Иными словами, такие клетки находятся в том же ряду исключений из правила, что и дрозофила.

ВМЕСТО ЗАКЛЮЧЕНИЯ

Какие же практические выводы следуют из того, что на сегодняшний день удалось узнать о связи между активностью теломеразы, раковым ростом и старением клеток. Казалось бы, они лежат на поверхности: не хочешь стареть - активируй теломеразу; хочешь убить раковую опухоль - убей в ней сначала теломеразу.

Легковесность первого вывода (а именно его подхватили средства массовой информации) очевидна: между культурой клеток и клеточной тканью, а тем более организмом дистанция огромного размера. Еще не пришло время всœерьез обсуждать проблему получения трансгенных органов человека для пересадки их больным людям (хотя теоретически это, конечно, возможно). А главное, процесс старения не только организма, но и клетки - это исключительно сложный комплекс изменений во множестве биохимических реакций, и его вряд ли можно повернуть вспять, воздействуя только на какую-то одну из них. В то же время существуют вполне реальные планы активировать теломеразу в клетках кожи, которую пересаживают пациентам с сильными ожогами, и тем самым активировать их рост. Или попытаться тем же путем "омолодить" клетки сетчатки глаза, взяв их у пациента͵ страдающего помутнением сетчатки (а это широко распространенное заболевание у пожилых людей, ведущее к слепоте), и затем вернуть назад.

Что же касается разработки методов избирательного подавления теломеразной активности в раковых опухолях, то сейчас это важное направление в поиске новых средств борьбы со злокачественными заболеваниями. Пока большинство работ связано с испытанием ингибиторов обратных транскриптаз (каталитических субъединиц теломераз). Опыт борьбы со СПИДом, где пытаются решить аналогичную задачу, говорит о том, что определœенные надежды найти такое лекарство есть. Главная трудность заключается в том, что каталитическая субъединица теломеразы - это одна из ДНК-полимераз и искомый ингибитор должен быть направлен именно на теломеразную ДНК-синтезирующую активность. В противном случае он будет токсичен для нормальных клеток.

Более перспективными кажутся недавно появившиеся работы, в которых описано избирательное подавление теломеразной РНК, вызывающее гибель раковых клеток в культуре. В нормальных клетках, как это мы отмечали выше, теломеразная РНК синтезируется, но эти клетки лишены теломеразной активности и, скорее всœего, теломеразная РНК им не нужна.

Изучение тонкой структуры теломер и механизма действия теломераз находится еще только в начальной стадии. При этом они привлекают к себе огромный интерес исследователœей, работающих в самых разных областях биологии и медицины, и здесь уже в ближайшее время можно ждать новых интересных открытий.


Процессинг РНК. Теломеры и теломераза - 2020 (c).
Яндекс.Метрика