Главная » Фармацевтическая микробиология » 32. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
 Уникализировать текст |
Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы:
1. Диффузионные методы:
• с использованием дисков с антибиотиками
• с помощью Е-тестов
2. Методы серийных разведений:
• разведение в жидкой питательной среде (бульоне)
• разведение в агаризованной среде
Методы определения чувствительности были разработаны во второй половине 60-х – начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений.
Для всех методов общими являются следующие этапы:
- приготовление и проверка качества питательных сред
- приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма)
- инокуляция
- для дифузионных методов – этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.
- инкубирование
- учет и интерпретация результатов
- формулировка рекомендаций по Лечению
Диффузионные методы основаны на диффузии антибактериального препарата (АБП) из носителя в плотную питательную среду, инокулированную микроорганизмом, и регистрации диаметра зоны ингибирования (задержки) роста исследуемого микроорганизма.
• Метод менее чувствителен и менее точен, чем метод серийных разведений, но на практике применяется чаще из-за своей простоты. Размещено на реф.рф.
• Скорость диффузии в агар любого препарата зависит от его структуры, молекулярной массы, наличия примесей, состава и рН среды.
Метод бумажных дисков с антибиотиком (дискодиффузионный метод).
• Для проведения этого метода используют стандартные диски, содержащие определенное количество антибиотиков, и стандартную питательную среду, необходимую для роста данного вида микроорганизма. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. • На поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности. • Помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. • Инкубируют при уcловиях, благоприятных для каждого конкретного микроорганизма. • Измеряют диаметры зон задержки роста вокруг диска в миллиметрах (с учетом диаметра диска). • Оценивают результат по специальной таблице путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны в таблице. • Исследуемую культуру относят к одной из трех категорий: чувствительная, умеренно- чувствительная и устойчивая
Е-тест (E-test или эпсилометрический метод)
Метод близок по технологии постановки к методу бумажных дисков.
• В качестве носителя используется узкая полоска полимера (0.5х6.0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Значения концентрации АБП в каждом участке полоски нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности.
• Ингибирование роста микроорганизма вокруг полоски носителя происходит в зоне, где концентрация антибиотика, диффундирующего из носителя, выше МПК.
• В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е- теста получают значение МПК.
Е-тест сочетает простоту постановки метода бумажных дисков и точность метода серийных разведений
Методы, используемые для сравнительной оценки in vitro лекарственных средств антимикробной терапии: метод серийных разведений в жидкой и плотной питательных средах.
Методы серийных разведений:
• Позволяют количественно оценить чувствительность выделенного микроорганизма к антибактериальным средствам и определить МПК препарата.
• Используют для сравнительной оценки антимикробной активности in vitro разрабатываемого препарата-генерика и оригинального средства.
• Для определения величины МПК заданные концентрации антибиотиков вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.
• Основаны на использовании двукратных последовательных разведений концентраций АБП от максимальной к минимальной (например, от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл).
• Проводятся в жидкой и агаризованной питательных средах. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде (бульоне)
Существует 2 варианта данного метода:
макрометод (пробирочный) и микрометод (планшетный).
Макрометод .
• Тестирование проводят в пробирках в конечном объеме 1 мл для каждого разведения.
• Питательный бульон разливают по 0,5 мл в каждую пробирку. Количество пробирок определяют необходимым диапазоном разведений АБП.
• Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов:
- Из стандартной суспензии каждого исследуемого микроорганизма (~ 10 8 КОЕ/мл) готовят рабочую суспензию ( ~ 10 6 КОЕ/мл) • Приготовление двукратных серийных разведений АБП: - готовят основной раствор АБП исследуемого препарата-генерика и препарата сравнения (оригинального) в концентрации 1000 мкг/мл и выше (с учетом содержания содержания активного вещества). -из основных растворов АБП исследуемого препарата-генерика и препарата сравнения (оригинального) готовят рабочие растворы АБП с использованием жидкой питательной среды. (Концентрация рабочих растворов рассчитывается исходя из необходимой максимальной концентрации в ряду серийных разведений с учетом фактора разбавления при последующей инокуляции суспензией микроорганизма) ‐ готовят серийные разведения: 0,5 мл рабочего раствора АБП вносят в первую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона. Перемешивают. Новой пипеткой (наконечником) переносят 0,5 мл раствора АБП в бульоне во вторую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона и т.д., пока не будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0,5 мл удаляют. Т.о., получают ряд пробирок с растворами АБП, концентрации в которых отличаются в соседних пробирках в 2 раза • Инокуляция: по 0,5 мл микробной суспензии с концентрацией микроорганизма ~ 10 6 вносят в каждую пробирку с 0,5 мл соответствующего разведения АБП. Конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке ~ 5х10 5 КОЕ/мл. • Контроль – пробирка с бульоном и культурой микроорганизма (контроль роста). Отрицательный контроль – пробирка с бульоном (контроль стерильности). • Инкубирование: все пробирки, закрытые пробками, или колпачками, инкубируют при условиях, обеспечивающих рост испытуемых микроорганизмов. • Учет и интерпретация результатов: пробирки с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культуры в пробирке с АБП сравнивают с контрольной пробиркой. - наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. ‐ по мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). лекарственных средств антибактериальной терапии - сравнивают результаты, полученные для оригинального ЛС и исследуемого генерического ЛС. Делают вывод об их эквивалентности в отношении спектра (перечень используемых микрорганизмов) и степени антимикробной активности (значения МПК).
• Определение МБК: из нескольких последних пробирок с задержкой роста делают посев петлей на сектора чашки Петри. За МБК, которая, как правило, на несколько разведений меньше МПК, принимают концентрацию препарата в последней пробирке, посев из которой не дал роста. • Недостаток метода: низкая производительность – применение ограничивается исследованиями небольшого числа микроорганизмов.Микрометод
•Процедура проведения испытания аналогична таковой при использовании макрометода
•Величина конечного объема – до 0,2 мл •Наличие соответствующего оснащения лаборатории: планшет на 96 лунок со стерильными крышками, многоканальных пипеток •Рабочие растворы АБП можно вносить в лунки планшет заранее, после чего хранить запаянными в полиэтилене при температуре ниже 60°С до момента использования. • Преимущества метода: - высокая производительность - возможность длительного хранения заранее приготовленных планшет - экономия расходных материалов. Размещено на реф.рф
Метод серийных разведений в агаризованной среде • Принцип проведения испытания аналогичен методу разведений в бульоне • Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов: - стандартная суспензия каждого исследуемого микроорганизма должна содержать ~ 10 8 КОЕ/мл. - стандартную микробную суспензию для проведения эксперимента разводят ~ в 10 раз до получения концентрации микроорганизма ~ 10 7 КОЕ/мл • Приготовление двукратных серийных разведений АБП для оригинального препарата и исследуемого препарата- генерика проводят аналогично методу разведений в бульоне • Агаризованную среду расплавляют и охлаждают до температуры 45-50°С. • Приготовление чашек с агаризованной средой и разведениями АБП: смешивают агаризованную среду и растворы АБП непосредственно в чашке Петри (для пластиковых чашек диаметром 90 мм к 2 мл раствора АБП добавляют 18 мл расплавленного и охлажденного агара). • Инокуляция и инкубирование: бактериологической петлей переносят 1-2 мкл суспензии исследуемых микроорганизмов на поверхность агаризованной среды. Таким образом, конечная посевная доза составляет ~ 10 4 КОЕ (стандартная бактериологическая петля диаметром 3 мм переносит 1-2 мкл жидкости). • На поверхности агара образуется пятно диаметром 5-8 мм. После подсыхания чашки переворачивают и инкубируют при условиях, благоприятных для роста исследуемых микроорганизмов. • Учет и интерпретация результатов: аналогично методу разведения в бульоне. Чашки Петри помещают на темную, не отражающую свет поверхность. За МПК принимают концентрацию АБП, вызвавшую полное ингибирование видимого роста. • Контроль: инокулированные суспензией культур микроорганизмов чашки с агаром без АБП (контроль роста). Отрицательный контроль: чашки с агаром (контроль стерильности). Преимущества метода: на одной чашке можно определять чувствительность нескольких микроорганизмов.
Объем исследований по сравнительной оценке in vitro антимикробной активности для генерических и оригинальных средств антимикробной терапии.
Объем исследований по сравнительной оценке in vitro антимикробной активности генерических противомикробных лекарственных средств:
•Задача исследования: подтверждение соответствия генерического препарата референсному (оригинальному) по спектру (микроорганизмы) и степени (значение МПК, МБК) антимикробной активности.
•Набор тестируемых микроорганизмов: по 1-2 штамма каждого из входящих в спектр действия микроорганизмов
- эталонные коллекционные штаммы
-выделенные в стационарах клинические штаммы
•Определяются значения МПК и МБК
•Контроль: препарат сравнения – оригинальный препарат
•Ожидаемый результат: МПК и МБК разрабатываемых генерических противомикробных ЛС входят в допустимые диапазоны значений и полностью совпадают с МПК и МБК препаратов сравнения (оригинальных ЛС) в отношении коллекционных и клинических штаммов.
Порядок исследований по определению in vitro антимикробной активности новых противомикробных соединений:
•Первичная оценка чувствительности к новым соединениям эталонных штаммов различных видов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов (4-5 штаммов для каждого вида);
•Детальное изучение степени антибактериальной активности соединений в отношении штаммов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов из международных коллекций с известными механизмами резистентности (метод серийных разведений);
•Исследование активности в отношении клинических штаммов условно патогенных и патогенных микроорганизмов в сравнении с известными препаратами близкой химической группы или аналогичными по антимикробному эффекту:
- в случае преимущественной активности в отношении грамположительных микроорганизмов контроль – природные пенициллины, цефалоспорины I – II поколений, макролиды, линкозамиды; - при активности в отношении грамотрицательных микроорганизмов контроль – полимиксин В, азтреонам; -для препаратов широкого спектра действия контроль – полусинтетические пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины, цефалоспорины III – IV поколений
• Оценка антимикробной активности в отношении проблемных возбудителей: метициллинорезистентные стафилококки, устойчивые к бензилпенициллину Streptococcus pneumonia, множественноустойчивые энтеробактерии, устойчивые к аминогликозидам бактерии рода Pseudomonas и др.
•Первоначальные терапевтические концентрации новых препаратов устанавливаются с учетом токсичности, определенной в опытах по изучению острой токсичности;
• Сравнительную степень антибактериальной активности препаратов оценивают величиной МПК или МБК, определяемых не менее, чем при 2-х значениях посевной дозы: минимальной – 10 4 – 10 5 КОЕ/мл и максимальной – 10 6 – 10 9 КОЕ/мл в зависимости от вида возбудителя; На сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.
« назад
Оглавление
вперед »
31. Противомикробные лекарственные средства, классификация « | » 33. Валидация методик испытаний: виды и порядок проведения валидации
31. Противомикробные лекарственные средства, классификация « | » 33. Валидация методик испытаний: виды и порядок проведения валидации
 Похожие работы: |
|
 Воспользоваться поиском |
Концепции современного естествознания